非对称糖基化IgG1抗体普遍存在并驱动人类疾病

《Nature Communications》：Asymmetrically glycosylated IgG1 antibodies are universal and drive human disease

本研究针对传统糖基谱分析技术无法解析IgG抗体Fc区N297位点糖基化空间配对信息的瓶颈，开发了WIgGWAM完整质谱分析新方法。研究人员发现人体内普遍存在非对称糖基化IgG1抗体，并首次证实登革热疾病严重程度与单岩藻糖基化（而非完全去岩藻糖基化）密切相关。通过工程化单岩藻糖基化抗体，研究揭示了其通过高亲和力结合FcγRIIIA驱动抗体依赖性增强作用的分子机制，为抗体药物优化和疾病机制理解提供了新范式。

　　

在免疫学的精密世界里，抗体犹如一把双刃剑，既能精准清除病原体，也可能在某些情况下加剧疾病发展。免疫球蛋白G（IgG）作为人体内含量最丰富的抗体类型，其Fc片段上的糖基化修饰如同调控其功能的“密码锁”，尤其是Asn297位点的N-连接聚糖，深刻影响着抗体与Fcγ受体（FcγR）的结合亲和力，进而调控抗体依赖性细胞毒性（ADCC）、抗体依赖性细胞吞噬（ADCP）等关键效应功能。过去几十年的研究已经将特定糖型与多种感染性和自身免疫性疾病的严重程度联系起来，例如，去岩藻糖基化能显著增强IgG与FcγRIIIA的结合，从而提升抗肿瘤抗体疗效；而唾液酸化则与抗炎效应相关。

然而，当前对IgG糖基化的认知存在一个根本性的盲区。传统的糖基化分析主要依赖于糖链释放技术，即使用PNGase F等酶将糖链从抗体上切割下来后进行质谱分析。这种方法虽然能鉴定糖链的类型和丰度，却丢失了一个至关重要的维度信息：IgG分子是一个同源二聚体，每个Fc单体上都携带一个Asn297糖链，这两个糖链完全有可能不同——即存在“非对称糖基化”。由于技术限制，这一普遍存在的生物学现象长期被忽视，其生理病理意义更是未知。与此同时，结构生物学研究显示，Fc与Fcγ受体的结合本身就是不对称的，这从理论上暗示了非对称糖基化可能具有独特的生物学功能。为了揭开IgG糖基化世界的这层“面纱”，由Tala Azzam、Jonathan J. Du和Eric J. Sundberg等领导的研究团队在《自然-通讯》（Nature Communications）上发表了他们的最新突破。

研究人员为开展此项研究，主要应用了几项关键技术：首先，他们开创了名为“全免疫球蛋白糖基谱分析与非对称监测”（WIgGWAM）的完整液相色谱-质谱（LC/MS）方法，该方法通过木瓜蛋白酶切和Protein A纯化获得Fc片段，在非还原条件下进行质谱分析，从而保留了两个糖链的配对信息。其次，他们利用内切糖苷酶EndoS2处理和一系列外切糖苷酶（如AlfC、BgaA、MvNA）消化，辅助糖型的鉴定和验证。第三，研究纳入了多个人群队列样本，包括健康对照、COVID-19患者以及来自柬埔寨的登革热患者血浆样本（样本收集获柬埔寨国家卫生研究伦理委员会批准），并分析了来自B细胞培养上清液和基因工程人源化IgG1小鼠的抗体。第四，他们通过“孔洞-塞”（Knob-in-hole, KiH）突变和点突变（如A330W, E269I/E269M）结合糖基工程（使用糖苷酶CU43、AlfC和糖合成酶EndoS2D184M进行糖链重塑）技术，精准构建了单岩藻糖基化、双岩藻糖基化和去岩藻糖基化的重组抗体。最后，利用表面等离子共振（SPR）技术测定抗体与Fcγ受体的亲和力，并在Fcγ受体人源化小鼠模型中进行体内功能验证（如登革热抗体依赖性增强感染模型和CD4+ T细胞清除模型）。

WIgGWAM enables intact LC/MS glycoprofiling of polyclonal human IgG1 antibodies while preserving the spatial pairing of the Asn297-linked glycans

研究人员开发了WIgGWAM方法。其流程是：用木瓜蛋白酶切IgG，分离出Fc片段，经Protein A纯化后进行完整质谱分析。该方法通过设定20%最大峰高的过滤阈值，并结合EndoS2处理（将糖链降解至只剩核心GlcNAc和岩藻糖）以及外切糖苷酶（如唾液酸酶、半乳糖苷酶）验证，确保了结果的可重复性和准确性。应用该方法分析健康人血浆样本，成功鉴定出包括对称和非对称在内的多种糖型，证明了方法的有效性。

WlgGWAM identifies both symmetric and asymmetric IgG glycoforms

为了验证WIgGWAM不会改变样品本身的糖型谱，研究人员首先分析了商品化重组利妥昔单抗（Rituximab）。对比全分子IgG和经WIgGWAM处理后的Fc片段的质谱图，发现主要糖型的相对比例没有显著差异，表明该方法可靠。更重要的是，分析显示重组表达的IgG1本身就存在约51%的非对称糖型和30%的对称糖型（其余19%因质量相同无法区分），这首次明确揭示了非对称糖基化在IgG生产过程中是普遍现象。

Asymmetric glycosylation is prevalent in the periphery of humans and IgG1 humanized mice

将WIgGWAM应用于混合人血浆和血清样本，发现无论是常见的G1m1还是nG1m1 Fc等位基因，其IgG1抗体均以非对称糖型为主。同样，在基因工程改造的、只表达人IgG1恒定区的小鼠血清中，超过70%的IgG1糖型也是非对称的。这表明非对称糖基化是哺乳动物体内抗体产生的固有特征，而非个别现象。

Asymmetric glycosylation is present in every individual human sample and is regulated by the B-cell differentiation pathway

为了确认非对称糖基化是否存在于每一个个体中，研究人员对31份个体血浆样本（包括健康人和COVID-19患者）进行了分析。结果显示，无论个体的Fc等位基因型是纯合还是杂合，无论健康与否，每个个体的IgG1抗体都呈现出高比例的非对称糖基化（平均约占60%），对称糖型仅占27%。这表明非对称糖基化是人体内的普遍规律。进一步研究发现，B细胞的分化途径调控着非对称糖基化的模式。体外刺激记忆B细胞发现，相较于TLR激动剂（R848, CpG）模拟的T细胞非依赖性活化，CD40L（模拟T细胞依赖性活化）刺激能导致分泌的IgG具有更高水平的总半乳糖基化、非对称半乳糖基化以及总唾液酸化和非对称唾液酸化。这提示B细胞活化途径差异性地调控着抗体糖基化的对称性。

Monofucosylation is a prevalent feature of peripheral hIgG1 antibodies and is associated with secondary and severe dengue disease

研究聚焦于登革热这种已知抗体糖基化与疾病严重性密切相关的疾病。传统糖链释放研究表明，登革热重症与IgG的去岩藻糖基化（afucosylation）相关。利用WIgGWAM方法，研究人员精准分析了58名登革热患者血浆中的IgG1糖型，并首次在人群水平区分了双岩藻糖基化（bifucosylation）、单岩藻糖基化（monofucosylation）和完全去岩藻糖基化。结果出乎意料：与轻症登革热（DF）相比，重症登革出血热/登革休克综合征（DHF/DSS）患者中，IgG1的双岩藻糖基化显著降低，但这种降低主要是由于单岩藻糖基化的显著增加所致，而非完全去岩藻糖基化。同样，在二次感染（相较于初次感染）中，也观察到了单岩藻糖基化的显著增加。这表明，驱动登革热抗体依赖性增强（ADE）的关键糖型是单岩藻糖基化IgG1。

Monofucosylated IgG1 binds Fc receptors and induces effector functions similarly to fully afucosylated IgG1

为了验证上述发现，研究人员通过精巧的糖基工程策略，成功构建了单岩藻糖基化的抗登革病毒E蛋白抗体（C10）和抗CD4抗体（YTS191）。表面等离子共振（SPR）实验表明，单岩藻糖基化IgG1与FcγRIIIA的结合亲和力（K_D= 56 nM）与完全去岩藻糖基化IgG1（K_D= 39 nM）高度相似，且均显著高于双岩藻糖基化IgG1（K_D= 129 nM）。体内实验进一步证实：在FcγR人源化小鼠模型中，无论是登革热病毒感染增强模型还是CD4+ T细胞清除模型，单岩藻糖基化抗体都表现出与完全去岩藻糖基化抗体同等强大的效应功能，而双岩藻糖基化抗体则活性很弱。这从功能上证明了单岩藻糖基化足以驱动严重的病理反应。

Monofucosylated IgG1 binds to FcyRIIIA in a high-affinity orientation

机制探索表明，Fc与FcγRIIIA的结合是不对称的，其中一条Fc链（定义为链A）与受体的相互作用（如蛋白侧链相互作用和糖-糖相互作用）对高亲和力结合至关重要。研究人员通过引入能特异性破坏链A结合（如E269I或E269M突变）的突变体并进行结合实验，证实单岩藻糖基化IgG1是以一种“高亲和力取向”与受体结合，即其去岩藻糖基化的那条链恰好位于能形成最多有利相互作用的链A位置，从而模拟了完全去岩藻糖基化IgG的高亲和力结合模式。

综上所述，这项研究突破了传统糖基化分析的局限，通过开发WIgGWAM新技术，首次在群体水平上系统揭示了非对称糖基化，特别是单岩藻糖基化，是IgG1抗体的普遍特征和关键功能调控因子。研究不仅纠正了长期以来关于登革热重症由完全去岩藻糖基化驱动的认知，指出单岩藻糖基化才是更相关且更常见的致病因素，还通过工程化抗体和体内外实验证实了单岩藻糖基化抗体具有与完全去岩藻糖基化抗体等效的增强效应功能。这一发现具有多重重要意义：首先，它深化了我们对抗体糖基化生物学功能的理解，提出了“糖基化层级效应”的新概念，即在不均一的糖基化配对中，具有更高活性的那个糖链可能主导了整个抗体与受体的相互作用。其次，为抗体药物研发提供了新思路，单岩藻糖基化抗体或许能成为完全去岩藻糖基化抗体的有效替代品，可能在生产上更具优势。最后，该研究为多种与抗体糖基化相关疾病的诊断、预后判断和治疗提供了新的潜在靶点和分析框架。未来，将非对称糖基化分析拓展至其他糖型修饰（如半乳糖基化、唾液酸化）以及IgG其他亚类、自身免疫病和癌症等更广泛的疾病背景中，必将进一步揭示抗体糖生物学世界的复杂性与精密性，推动精准医疗的发展。