植物Augmin复合物的冷冻电镜结构揭示其卷曲螺旋组装、反向平行二聚化及NEDD1结合机制

《Nature Communications》：Cryo-EM structures of plant Augmin reveal coiled-coil assembly, antiparallel dimerization, and NEDD1 binding

本研究针对微管分支成核过程中Augmin复合物结构机制不明的关键问题，研究人员通过冷冻电镜技术解析了拟南芥Augmin异源八聚体的高分辨率结构，揭示了其V形连接区的开放/闭合构象变化、通过延伸区进行的反向平行二聚化机制，以及NEDD1-WDβ-螺旋桨结构域在V连接区内的结合位点。该研究为理解γ-TuRC招募和微管分支成核提供了重要结构基础。

　　

在真核细胞中，微管（Microtubule, MT）是细胞骨架的重要组成部分，参与维持细胞形态、细胞内物质运输和细胞分裂等关键生命活动。微管的形成依赖于一种名为γ-微管蛋白环状复合物（gamma-tubulin ring complex, γ-TuRC）的巨型蛋白机器，它能够像“模板”一样启动微管的聚合。然而，在动物细胞的间期，γ-TuRC主要位于中心体，从而形成以中心体为核心的放射状微管网络；而在缺乏中心体的植物细胞以及所有真核细胞的有丝分裂期，新的微管会像树枝一样从已有的微管侧面“分支”产生，这个过程被称为“微管分支成核”。这种分支成核对于构建植物细胞间期近乎平行的皮层微管阵列以及有丝分裂过程中精确的双极纺锤体至关重要。

那么，是谁将γ-TuRC精准地“招募”到已有的微管上并激活其成核功能的呢？答案是Augmin蛋白复合物及其搭档NEDD1蛋白。Augmin是一个由8个不同亚基（在植物中称为AUG1-8）组成的形似“音叉”的复合物，而NEDD1则是一个包含WD40β-螺旋桨结构域的衔接蛋白。尽管它们的功能已知，但由于Augmin复合物结构高度延长且灵活，其精确的三维结构、如何结合微管、如何与NEDD1协作以及如何进一步形成寡聚体以发挥功能等关键机制，长期以来一直是领域内难以破解的谜团，限制了人们对微管网络组建机制的深入理解。

为了回答这些根本性问题，由美国加州大学戴维斯分校Jawdat Al-Bassam教授领导的研究团队，在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们成功重组了拟南芥（Arabidopsis thaliana）的Augmin复合物，并利用冷冻电镜（cryo-EM）技术，首次解析了其接近完整的结构，揭示了其独特的组装方式、动态构象变化、二聚化能力及其与NEDD1的相互作用界面，从而为理解微管分支成核的分子机制提供了前所未有的见解。

研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先，他们通过多顺反子载体在细菌中重组表达并纯化了拟南芥Augmin的异源八聚体（AUG1-8）和异源四聚体（AUG1,3,4,5）复合物，并利用尺寸排阻色谱-多角度激光光散射（SEC-MALS）和质谱光度法（Mass Photometry）验证了组装体的化学计量和均一性。其次，他们利用单颗粒冷冻电镜技术，通过对不同区域进行颗粒重定位、局部分类、柔性拟合和局部重构等策略，分别解析了Augmin的V形连接区-茎部区域（分辨率为7.3 ?和10 ?，对应闭合和开放两种构象）、延伸区域（分辨率为3.7 ?）以及反向平行二聚体（分辨率为12 ?）的结构。此外，他们还通过交联质谱（XL-MS）技术获得了大量亚基内和亚基间的交联数据，用于验证和约束结构模型。同时，他们通过蔗糖密度梯度离心和凝胶过滤色谱验证了NEDD1的WDβ-螺旋桨结构域与Augmin复合物的结合，并解析了二者复合物的冷冻电镜结构（分辨率为10 ?）。最后，他们运用直接耦合分析（Direct Coupling Analysis, DCA）这一生物信息学方法，基于进化共变信号，独立地验证了Augmin八亚基组装模型以及NEDD1与Augmin的结合界面。

Augmin复合物的生化重组与结构解析

研究团队成功重组并纯化了拟南芥Augmin的全长异源八聚体（AUG1-8）和核心异源四聚体（AUG1,3,4,5）。冷冻电镜二维分类平均值直观地展示了全长Augmin典型的40纳米“音叉”形状，包括一个V形连接区（V-junction）和一个长长的延伸区域（extended region）。通过复杂的图像处理策略，他们最终拼凑出一幅近乎完整的Augmin三维结构图。该结构显示，Augmin的30纳米延伸区域主要由AUG1,3,4,5构成，形成一个包含“腹部”（belly）、“腿部”（leg）和“三脚架”（tripod）的多结构域组装体。而V形连接区则由AUG2,6,7,8的C端区域组装在由AUG3和AUG5折叠形成的平台上构成，其末端是AUG6和AUG7的钙调蛋白同源（CH）结构域二聚体形成的“头部”（head）。

Augmin的卷曲螺旋组装与构象动态

高分辨率结构揭示了Augmin亚基之间复杂而精密的卷曲螺旋相互作用网络。AUG3和AUG5形成一个平行的长卷曲螺旋异源二聚体，构成了整个Augmin结构的“脊柱”。AUG1和AUG4则通过并行和反并行的方式与AUG3/AUG5的不同区域交织，稳定了延伸区域的“腹部”和“腿部”。特别有趣的是，研究人员在V形连接区的头部观察到了AUG6/7 CH结构域二聚体的两种构象状态：一种是两个CH结构域紧密并列的“闭合”状态，另一种是两者张开的“开放”状态。这种构象变化与V形连接臂的旋转相偶联，提示其可能在微管结合中发挥调节作用。

Augmin的反向平行二聚化

二维分类和三维重构均发现，Augmin分子可以通过其延伸区域进行“头对尾”式的反向平行二聚化。解析出的二聚体结构显示，二聚化界面主要发生在两个Augmin分子的“腹部”和“三脚架”区域。交联质谱数据进一步支持了这一模型，显示在二聚体状态下，这些界面区域的氨基酸残基之间的距离比在单体中更短。这种二聚化能力暗示Augmin可能在微管上形成更大的寡聚体平台，从而更有效地招募和锚定γ-TuRC。

NEDD1与Augmin V形连接区的结合

通过生化实验，研究人员证实NEDD1的WDβ-螺旋桨结构域能够特异性地与完整的Augmin八聚体结合，而不能与缺少AUG2,6,7,8亚基的AUG1,3,4,5四聚体结合，这表明NEDD1的结合位点位于Augmin的V形连接区内。冷冻电镜结构显示，NEDD1-WDβ-螺旋桨确实结合在V形连接区的内部，靠近AUG2,6,7,8亚基。更有意思的是，NEDD1的结合能够轻微增强Augmin的二聚化倾向，提示其可能通过变构效应调节Augmin的组装状态。

进化共变分析验证结构与相互作用

为了从进化角度验证其结构模型的可靠性，研究团队对Augmin八个亚基以及NEDD1在不同真核生物中的序列进行了直接耦合分析（DCA）。分析结果显示，Augmin各亚基之间存在大量显著共变的残基对，这些残基对在空间上恰好位于亚基间的相互作用界面，独立地证实了八亚基组装模型的正确性。同时，DCA也预测出了NEDD1与Augmin V形连接区亚基之间的共变残基对，其预测的结合界面与实验测得的冷冻电镜结构高度一致，为两者的功能性相互作用提供了强有力的进化证据。

综上所述，这项研究通过整合结构生物学、生物化学和生物信息学方法，首次揭示了植物Augmin复合物的精细结构和动态组装机制。研究结论表明，Augmin通过其V形连接区末端的双CH结构域（可能以开放/闭合两种状态）以及结合在连接区内的NEDD1，形成双位点微管结合模式，从而稳定地锚定在微管晶格上。其延伸区域则具备反向平行二聚化的能力，可能形成一个用于招募和激活γ-TuRC的平台。NEDD1的结合不仅提供了额外的微管结合位点，还可能通过促进Augmin的二聚化来增强其功能。

这项研究的意义在于，它将Augmin和NEDD1从功能已知但结构模糊的“黑箱”状态，提升到了具有明确三维结构和动态机制的可理解层面。所提出的Augmin工作机制模型为解释其在微管分支成核中的核心作用提供了坚实的结构基础，增进了我们对细胞骨架组织、特别是植物细胞和细胞分裂过程中微管网络构建机制的理解。这些发现对深入研究相关发育缺陷和疾病（如某些神经性疾病与Augmin/NEDD1功能失常相关）的分子病因也具有重要的启示作用。