ReTagX：一种用于活细胞纳米镜检和单分子追踪的明亮可再生阵列标签

《Nature Communications》：A bright and regenerative array tag with fluorogenic ligands for long-term live-cell nanoscopy and single-molecule tracking

本研究针对活细胞荧光纳米镜检和单分子追踪中荧光标签亮度低、尺寸大、光漂白不可逆等瓶颈问题，开发了ReTagX系统。该系统通过可逆、荧光生成的标记策略，实现了光漂白信号的快速恢复，将STED成像帧数从不足5帧提升至300帧以上，单分子追踪时间延长约2.9倍，为长时程、高分辨率活细胞成像提供了强大工具。

　　

在生命科学领域，看清细胞内的微观世界一直是科学家们孜孜不倦的追求。荧光成像技术的出现让我们能够窥见细胞的内部结构，而超分辨率显微镜（SRM）更是突破了光的衍射极限，将分辨率提升至纳米级别。然而，就像用高倍望远镜观察星空时星星会逐渐暗淡一样，荧光分子在激光照射下会发生不可逆的光漂白，这成为长时程活细胞成像的主要障碍。

传统的荧光蛋白标签和自标记蛋白标签（如Halo-Tag、SNAP-tag）虽然广泛应用于蛋白质标记，但它们存在亮度不足、尺寸过大以及光漂白不可逆等问题。特别是在STED显微镜中，高强度 depletion 激光使得成像帧数通常不足5帧，严重限制了动态过程的观察。单分子追踪（SMT）技术则因信号快速衰减而难以长时间跟踪蛋白质的运动轨迹。

针对这些挑战，思东娟、董志浩、邢刚等研究人员在《Nature Communications》上发表了一项创新性研究，开发了一种名为ReTagX的明亮、可再生、紧凑的阵列标签系统。这一系统通过结合高度荧光生成的配体和可逆标记策略，实现了光漂白信号的快速自我恢复，为长时程活细胞纳米镜检和单分子追踪提供了全新解决方案。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：通过化学合成优化罗丹明染料的螺环化平衡，开发出高度荧光生成的TMP-Tag配体；利用点突变技术对野生型TMP-Tag进行系统改造，获得具有快速可逆结合特性的ReTag1；构建多聚体ReTagX阵列标签增强亮度；应用STED、SIM、MINFLUX等多种超分辨率显微镜技术评估系统性能；建立活细胞单分子追踪平台分析膜蛋白动态行为。

高度荧光生成配体的开发

研究团队以磺酰胺修饰的碳罗丹明（MaP618m）为荧光报告基团，通过优化连接子长度，开发出MaP618m-TMP等高度荧光生成配体。该配体与TMP-Tag结合后，荧光强度增强190.2倍，且在10μM高浓度下仍保持极低背景信号（Fnuc/Fcyt = 203.8）。通过类似策略，研究人员还开发了覆盖绿色到红色光谱的多色荧光生成配体，包括MaP512-TMP、MaP555-TMP、SiR-TMP和MaP655-TMP。

可再生标签的工程化改造

野生型TMP-Tag与配体的结合过于稳定（Koff = 4.88×10^-7s^-1），不利于可逆标记。研究人员通过引入L28Q、R44L和H45Q突变，获得了ReTag1，其解离速率提高了266,000倍（Koff = 0.13 s^-1），实现了秒到分钟级别的可逆标记。荧光恢复后光漂白（FRAP）实验表明，ReTag1与高度荧光生成的MaP655-TMP配合，可在1-2分钟内恢复72.9%的荧光信号。

长时程活细胞纳米镜检应用

在STED纳米镜检中，ReTag1与MaP655-TMP的组合显著提升了成像持久性。线粒体外膜蛋白TOM20的STED成像从不足5帧扩展到300帧以上，实现了100分钟内80纳米分辨率的长时间观察，清晰记录了线粒体的分裂、融合和伸长等动态过程。在结构光照明显微镜（SIM）中，ReTag1也表现出优异的性能，能够以约100纳米的分辨率追踪细胞器动态。

ReTagX阵列用于单分子追踪

通过串联重复ReTag1构建的ReTagX阵列（如ReTag8，约156 kDa）显著提升了亮度（5.5倍）和追踪持续时间。肿瘤坏死因子受体2（TNFR2）-ReTag8的单分子追踪显示，超过80%的轨迹可维持5分钟以上，追踪持续时间比Halo-Tag延长约2.9倍，且对蛋白质的天然扩散行为影响极小。

该研究的创新性在于同时解决了荧光标记中的多个关键问题：通过高度荧光生成配体实现了超低背景成像，通过可逆标记实现了信号自我恢复，通过紧凑型阵列设计平衡了亮度与标签尺寸。ReTagX系统为研究细胞动态过程提供了强大工具，特别是在细胞器相互作用、蛋白质动态等需要长时间高分辨率观察的研究领域具有重要应用价值。未来，通过进一步优化探针的光稳定性和减少光毒性，这一技术有望在活体成像和临床诊断中发挥更大作用。

研究团队来自复旦大学、上海有机化学研究所、湖南大学等国内多家科研机构，工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金等项目的支持。该技术已申请专利保护，为超分辨率显微镜技术的进一步发展开辟了新方向。