USP29与SMURF1通过调控FSP1介导的铁死亡抑制促进胃癌化疗耐药性的机制研究

《Nature Communications》：USP29 and SMURF1 orchestrate FSP1-mediated ferroptosis suppression to facilitate chemoresistance in gastric cancer

胃癌化疗耐药是临床治疗的主要障碍。本研究揭示去泛素化酶USP29和E3泛素连接酶SMURF1通过双向调控铁死亡抑制蛋白FSP1的泛素化修饰，进而影响铁死亡进程和化疗敏感性。研究发现FSP1高表达与患者不良预后相关，而特异性抑制剂iFSP1可协同化疗药物逆转耐药。该研究为克服胃癌化疗耐药提供了新的生物标志物和治疗策略。

　　

胃癌是全球范围内发病率和死亡率均居高不下的恶性肿瘤类型，尤其在中国等东亚国家更为常见。尽管手术切除是早期胃癌的主要治疗手段，但多数患者确诊时已处于晚期，失去了手术机会。化疗因此成为晚期胃癌治疗的基石，但化疗耐药性的出现严重制约了治疗效果，导致疾病进展和患者预后不良。因此，深入探究胃癌化疗耐药的内在机制，并寻找有效的逆转策略，是当前胃癌研究领域的紧迫课题。

近年来，铁死亡（ferroptosis）作为一种铁依赖性的、由脂质过氧化驱动的调节性细胞死亡形式，在肿瘤发生发展和治疗抵抗中的作用日益受到关注。除了经典的谷胱甘肽-GPX4（谷胱甘肽过氧化物酶4）抗氧化系统外，铁死亡抑制蛋白1（Ferroptosis Suppressor Protein 1, FSP1）被证实是细胞内另一条重要的铁死亡抑制通路的关键分子。FSP1通过还原辅酶Q10（CoQ₁₀）生成具有抗氧化活性的泛醇，有效清除脂质过氧化物，从而抑制铁死亡。然而，FSP1在胃癌化疗耐药中的具体作用及其调控机制尚不明确。蛋白质的稳定性常常受到翻译后修饰的精细调控，其中泛素化修饰在决定蛋白质命运中扮演着核心角色。E3泛素连接酶负责为特定底蛋白添加泛素链，通常标记其通过蛋白酶体途径降解；而去泛素化酶（Deubiquitinating Enzymes, DUBs）则能去除泛素化修饰，从而稳定靶蛋白。这种双向调控对于维持蛋白质稳态至关重要。研究人员推测，可能存在特定的E3连接酶和DUB通过调控FSP1的泛素化水平来影响其蛋白稳定性，进而参与胃癌的化疗耐药过程。

为了验证这一假说，来自梅奥诊所、华中科技大学同济医学院附属协和医院、中国医学科学院肿瘤医院等机构的研究团队通力合作，在《Nature Communications》上发表了题为“USP29 and SMURF1 orchestrate FSP1-mediated ferroptosis suppression to facilitate chemoresistance in gastric cancer”的研究论文。该研究综合利用生物信息学分析、前瞻性临床队列、分子细胞生物学实验、动物模型以及患者来源类器官（Patient-Derived Organoids, PDOs）和患者来源异种移植瘤（Patient-Derived Xenograft, PDX）模型等多种技术手段，系统揭示了USP29-SMURF1-FSP1轴在胃癌化疗耐药中的关键作用及分子机制。

本研究的关键技术方法包括：利用加权基因共表达网络分析（WGCNA）筛选与顺铂耐药相关的关键基因；通过164例胃癌患者的前瞻性临床队列分析FSP1表达与化疗反应和预后的相关性；采用免疫共沉淀（Co-IP）、体外泛素化/去泛素化实验、蛋白质稳定性检测等分子生物学技术验证蛋白质相互作用和修饰；利用CRISPR-Cas9技术构建基因敲除细胞系；通过细胞活力检测、脂质过氧化水平分析（C11-BODIPY染色）评估铁死亡和化疗敏感性；并建立小鼠皮下移植瘤模型、胃癌患者来源类器官（PDO）和患者来源异种移植瘤（PDX）模型进行体内外药效评估。

FSP1表达作为胃癌化疗反应不良和生存预后差的指标

研究人员首先对公共数据库（GDSC）中癌细胞系对顺铂的敏感性数据进行了WGCNA分析，发现铁死亡通路与顺铂耐药显著相关，并进一步筛选出FSP1是连接顺铂耐药和铁死亡通路的关键基因。在包含164例接受新辅助化疗的胃癌患者的前瞻性队列中，免疫组化结果显示，FSP1高表达与患者对化疗的不良反应、较低的肿瘤退缩分级以及较差的生存期显著相关。此外，化疗后肿瘤组织中反映铁死亡水平的4-HNE（4-羟基壬烯醛）标记物与FSP1表达呈负相关，提示FSP1高表达抑制了化疗诱导的铁死亡。

FSP1通过抑制铁死亡赋予胃癌化疗耐药性

为了验证FSP1的功能，研究团队构建了胃癌顺铂耐药细胞系（AGS-R, MGC-803-R），发现其FSP1蛋白水平显著升高，而脂质过氧化水平降低。利用CRISPR-Cas9技术敲除FSP1后，耐药细胞对顺铂诱导的脂质过氧化和细胞死亡的敏感性显著增强。回补实验表明，只有具有豆蔻酰化修饰和辅酶Q氧化还原酶活性的野生型FSP1能挽救敲除效应，而功能缺失突变体（G2A, E156A）则不能。细胞死亡抑制剂筛选实验证实，只有铁死亡抑制剂Liproxstatin-1（Lip-1）能够逆转FSP1敲除带来的化疗增敏作用。在小鼠移植瘤模型中，FSP1敲除同样能增强肿瘤对顺铂的敏感性，且此效应可被Lip-1所逆转。这些结果明确了FSP1通过抑制铁死亡通路促进胃癌化疗耐药。

USP29结合并稳定FSP1

鉴于FSP1在耐药细胞中蛋白稳定性增加且泛素化水平降低，研究人员开始寻找调控其稳定性的DUB。通过筛选，发现USP29与FSP1存在强相互作用，且其酶活结构域（UCH domain）是结合所必需的。敲低USP29会降低FSP1蛋白水平（但不影响其mRNA），并缩短其半衰期，而蛋白酶体抑制剂MG132可以逆转此效应。回补野生型USP29可恢复FSP1水平，而催化失活突变体（C294S）则不能。进一步的体内外实验证明，USP29能够特异性去除FSP1上的K48连接的多聚泛素链，从而阻止其被蛋白酶体降解，起到稳定FSP1的作用。

USP29通过FSP1介导的铁死亡抑制实现胃癌化疗耐药

临床样本分析显示USP29与FSP1表达呈正相关，且USP29高表达预示患者预后不良。在胃癌耐药细胞中敲除USP29，可显著增强顺铂诱导的脂质过氧化和细胞毒性。回补野生型USP29而非催化失活突变体，或回补野生型FSP1而非功能缺失突变体，均能逆转USP29敲除导致的铁死亡增加和化疗增敏效应。体内动物实验进一步证实了USP29通过稳定FSP1促进化疗耐药的结论。

SMURF1促使FSP1降解并增强胃癌化疗敏感性

接下来，研究团队利用生物信息学工具预测并实验验证了SMURF1是介导FSP1泛素化的E3连接酶。SMURF1通过其WW结构域与FSP1相互作用。过表达SMURF1促进FSP1降解，而敲低SMURF1则稳定FSP1蛋白。SMURF1的催化活性对其调控FSP1稳定性至关重要。体内外泛素化实验证实SMURF1直接催化FSP1的泛素化。临床数据分析显示SMURF1与FSP1表达负相关，且SMURF1高表达患者预后更好。功能上，过表达SMURF1能增强耐药细胞的铁死亡和对顺铂的敏感性，此效应依赖于FSP1的降解。

SMURF1通过特异性泛素化位点调控FSP1稳定性进而影响GC化疗耐药

通过位点突变分析，研究人员确定了SMURF1主要介导FSP1蛋白上K63和K193位点的泛素化。双位点突变（K63R/K193R）或三位点突变（K63R/K193R/K225R）的FSP1蛋白其泛素化水平显著降低，稳定性增强。在功能挽救实验中，回补对SMURF1介导的降解不敏感的K63R/K193R突变型FSP1，能更有效地逆转SMURF1过表达所引发的化疗增敏效应，表明SMURF1主要通过K63和K193位点的泛素化来调控FSP1的稳定性和功能。

靶向FSP1逆转胃癌化疗耐药

基于上述发现，研究评估了FSP1特异性抑制剂iFSP1的治疗潜力。体外实验表明，iFSP1与顺铂或5-FU联用，在胃癌细胞系和化疗耐药细胞中均表现出协同抗肿瘤效应。在6例胃癌患者来源类器官（PDO）模型中，iFSP1同样能显著增强化疗药物的敏感性。尤为重要的是，研究团队从一例化疗后快速进展（提示耐药）的胃癌患者新鲜标本成功建立了PDX模型，在该高度模拟临床耐药情境的模型中，iFSP1联合顺铂治疗展现了强大的肿瘤抑制效果并能显著延长小鼠生存期。安全性评估显示联合用药未引起明显系统性毒性。

讨论与结论

本研究系统阐明了USP29和SMURF1通过双向调控FSP1蛋白稳定性，在胃癌化疗耐药中扮演的关键角色。USP29作为去泛素化酶，通过去除FSP1上的K48连接泛素链而稳定FSP1；反之，SMURF1作为E3连接酶，介导FSP1 K63/K193位点的泛素化，促进其降解。这一调控轴通过影响FSP1蛋白水平，最终决定胃癌细胞对铁死亡的敏感性，从而影响化疗效果。

该研究的创新性在于首次揭示了FSP1在蛋白质稳定性层面的精细调控机制，并明确了USP29-SMURF1-FSP1轴是连接泛素化修饰、铁死亡和化疗耐药的重要桥梁。临床队列分析和多种临床前模型（细胞系、动物模型、PDO、PDX）的结果一致表明，FSP1是预测胃癌化疗反应和预后的潜在生物标志物。更重要的是，研究发现靶向FSP1（使用iFSP1）能够有效逆转模型中的化疗耐药，为克服胃癌临床治疗难题提供了新的策略和靶点。由于FSP1敲除小鼠发育正常，而GPX4缺失则致死，提示靶向FSP1可能具有更好的安全性，使其成为极具潜力的治疗靶点。

总之，这项研究不仅深化了对胃癌化疗耐药机制的理解，特别是揭示了泛素化修饰调控铁死亡的新途径，而且为未来开发针对FSP1的联合治疗方案奠定了坚实的理论基础和实验依据，对改善胃癌患者预后具有重要的转化医学价值。