氨单加氧酶催化机制的结构解析：揭示氨氧化过程的分子基础与铜中心协同作用

《Nature Communications》：Structural insights into the catalytic mechanism of ammonia monooxygenase

本研究针对氨单加氧酶(AMO)结构信息匮乏制约氨氧化分子机制认知的难题，通过冷冻电镜技术成功解析了2.36 ?分辨率的AMO复合物结构。研究发现AMO形成异源五聚体同源三聚体结构，首次揭示了AmoD和AmoE两个新亚基的精确空间定位，并发现Cuc-CuD双核铜中心的协同占据模式。该研究通过水介导的氢键网络阐明了质子传递路径，其独特的表面静电特征为理解氨同化与物质运输机制提供了结构基础，对温室气体减排和农业氮素管理具有重要意义。

　　

在全球氮循环中，氨氧化作为硝化过程的关键限速步骤，主要由氨氧化细菌(AOB)、氨氧化古菌(AOA)和完全氨氧化微生物(comammox)共同催化。这些微生物通过氨单加氧酶(AMO)将氨(NH₃)转化为羟胺(NH₂OH)，该过程不仅影响自然界的氮素转化效率，更与温室气体氧化亚氮(N₂O)的排放直接相关。然而，由于AMO是一种膜嵌入的金属酶复合物，其精确的分子结构和催化机制长期以来笼罩在迷雾之中，这严重制约了我们对氨氧化过程的深入理解和相关环境应用的开发。

与AMO同属膜单加氧酶家族的颗粒性甲烷单加氧酶(pMMO)虽已有较多研究，但关于其真实活性中心的争议持续了二十余年。早期研究曾提出双核铜中心、单核铜中心等多种模型，而近期高分辨率结构才初步确认CuD位点可能是pMMO的活性中心。这些争议使得AMO催化机制的研究更加复杂，特别是铜离子的配位环境、底物结合位点及质子传递路径等关键科学问题亟待解答。

南方科技大学苏森方教授团队联合华东师范大学董宏坡教授课题组在《Nature Communications》发表了题为"Structural insights into the catalytic mechanism of ammonia monooxygenase"的研究论文。该研究从红树林沉积物中分离得到一株高活性的嗜盐硝化杆菌(Nitrosomonas halophila ZJB1)，通过基因工程技术在其AmoA亚基C端引入3×Flag标签，采用温和去污剂毛地黄皂苷(DIG)提取并纯化得到结构完整的AMO复合物。研究人员利用单颗粒冷冻电镜技术成功解析了2.36 ?分辨率的AMO三维结构，这是目前该领域获得的最高分辨率结构。

关键技术方法包括：从湛江湾红树林沉积物中分离纯化获得嗜盐硝化杆菌ZJB1菌株；建立遗传操作体系并构建AmoA-3×Flag标记菌株；通过亲和层析与尺寸排阻色谱纯化AMO复合物；利用冷冻电镜单颗粒分析技术进行结构解析；结合脂质组学分析鉴定与AMO相互作用的脂质分子；通过点突变和酶活测定验证关键氨基酸功能。

研究结果：

整体结构特征

AMO整体呈圆柱状(105 ? × 105 ? × 115 ?)，以异源五聚体同源三聚体形式组装。每个原聚体包含AmoA、AmoB、AmoC以及新发现的单次跨膜蛋白AmoD和可溶性蛋白AmoE五个亚基。结构中共鉴定出45个跨膜螺旋，其中AmoA贡献6个，AmoB贡献2个，AmoC贡献6个，AmoD贡献1个。中央孔道贯穿整个复合物，内部填充有双层脂质分子，脂质组学分析显示这些脂质主要为游离脂肪酸(FFA)、单酰基甘油(MG)、二酰基甘油(DG)和磷脂酰丝氨酸(PS)。

铜中心与质子传递路径

每个AMO原聚体包含三个铜配位点：位于AmoB N端β-桶状结构域的CuB位点，以及位于跨膜区的Cuc-CuD双核铜中心。值得注意的是，与以往仅观察到单个铜占据的模式不同，本研究首次直接观察到Cuc和CuD位点同时被铜离子占据的结构证据。五个跨膜螺旋(TM1来自AmoA，TM3、TM4、TM5和TM6来自AmoC)共同构成一个疏水通道，双核铜中心位于该通道顶端。AmoC的TM5螺旋发生分叉并向中央通道移动，扩大了疏水通道的容积以容纳双核铜配体。

序列比对显示TM5在AOB和甲烷氧化细菌(MOB)中高度保守，特别是参与CuD配位的组氨酸和天冬酰胺残基以及转角位点的残基均严格保守。在Cuc和CuD配体之间观察到两个明显的密度，可能代表水分子或源自双氧活化的氧物种。更重要的是，研究发现从CuB到Cuc-CuD活性中心存在一个广泛的水介导氢键网络，氢键距离从CuB附近的3.9 ?到Cuc附近的2.6 ?不等，这可能为氨氧化反应提供了高效的质子传递路径。

AmoD与新发现的AmoE

AmoD位于AmoC附近，其N端朝向细胞质，C端朝向周质。在AmoD与AmoC的界面处发现了两个磷脂分子：磷脂酰甲醇(PMeOH)和二酰基甘油(DG)，这些脂质相互作用可能有助于稳定AMO复合物的结构完整性并促进AmoD在膜环境中的正确整合。系统发育分析显示amoD基因仅存在于N. europaea/N. mobilis谱系中，其基因组定位与三羧酸循环(TCA)关键酶和信号分子(如c-di-GMP)合成相关基因相邻，表明AmoD可能在协调中心代谢向AMO的电子流中发挥作用。

可溶性蛋白AmoE由两个小螺旋(H1和H2)和两个柔性环(L1和L2)组成，通过静电相互作用与AmoB的N端cupredoxin结构域结合。AmoE的L1环插入由AmoA和AmoC周质区域以及AmoB N端cupredoxin结构域形成的负电性裂隙中，形成多个氢键和疏水相互作用。amoE基因的遗传邻域包含编码ATP酶和外膜β-桶组装机制复合物组分的基因，提示其可能参与内膜嵌入的AMO复合物与外膜相关组分间的协调作用。

表面静电势特征

AMO的表面静电势特征与pMMO存在显著差异。AmoB的周质β-桶结构域汇聚形成三个密集负电区域(DNR)，这可能有助于从环境中捕获带正电的铵离子。在脂双层赤道面分布有两对平行带电带：周质负电区域(PNR)和周质正电区域(PPR)，以及胞质负电区域(CNR)和胞质正电区域(CPR)。与pMMO胞质区密集的电荷分布不同，AMO表现出更均匀的电荷分布，这主要归因于AmoA、AmoC和AmoD相对于同源物PmoA和PmoC具有延伸的胞质区域。特别是AmoA的C末端延伸形成一个带正电的β发夹和一个带负电的螺旋，通过强静电相互作用以头对尾配置交织，在胞质AmoA三聚体内形成等边三角支架，这一结构安排对稳定三个相邻AMO原聚体具有关键作用。

研究结论与意义：

该研究通过高分辨率冷冻电镜结构解析，揭示了AMO的五亚基组成和独特的Cuc-CuD双核铜中心，为理解氨氧化分子机制提供了关键结构基础。水介导的质子传递路径和特殊的表面静电特征表明AMO与pMMO在底物识别和转化机制上存在重要分化。新发现的AmoD和AmoE亚基可能分别在代谢耦合和复合物组装中发挥重要作用。这些发现不仅深化了对氨氧化这一关键环境过程的理解，也为开发针对温室气体排放和农业氮素管理的调控策略提供了新视角。未来需要进一步的功能分析和更高分辨率研究来全面阐明底物结合中间体、明确AmoD和AmoE的具体作用，并最终揭示AMO的完整催化机制。