Polk和DNA修复通路协同抑制内源性鸟嘌呤损伤引发的组织特异性突变

《Nature Communications》：Tissue-specific mutagenesis from endogenous guanine damage is suppressed by Polκ and DNA repair

本研究针对内源性DNA损伤如何导致组织特异性突变这一难题，揭示了TLS聚合酶Polk通过无差错跨损伤合成抑制肝脏和肾脏中由内源性鸟嘌呤加合物驱动的C>A/G/T突变特征。研究人员通过小鼠模型、全基因组测序和DNA加合物组学技术，发现Polk与核苷酸切除修复(NER)通路协同防止内源性鸟嘌呤损伤积累，并鉴定出多个新型内源性DNA加合物。该研究为理解DNA损伤耐受与修复机制在维持基因组稳定性中的协同作用提供了新视角。

　　

生命体的遗传信息存储在DNA分子中，但DNA的稳定性时刻受到内外源因素的威胁。除了紫外线辐射等外源性损伤，细胞正常代谢过程也会产生大量内源性DNA损伤物质，如活性氧物种和简单醛类化合物。这些内源性损伤因子会攻击DNA分子，形成各种化学结构独特的DNA损伤。尽管内源性DNA损伤普遍存在，科学界对其具体类型、来源及其生物学效应仍了解有限。这主要是因为内源性DNA加合物含量极低、修复迅速，且与未修饰碱基性质相似，直接检测面临巨大挑战。

细胞进化出两套主要机制应对DNA损伤：DNA修复和DNA损伤耐受。核苷酸切除修复(NER)负责清除庞大、扭曲DNA双螺旋结构的加合物，如紫外线辐射引起的损伤。而当损伤逃逸修复或在DNA复制过程中被遇到时，细胞启用损伤耐受机制，其中跨损伤合成(TLS)是主要途径。TLS利用一系列特殊的DNA聚合酶在损伤位置进行DNA合成。哺乳动物拥有多个具有TLS活性的DNA聚合酶(Polη、Polκ、Polι、Rev1等)，这一过程受到Rev1和PCNA泛素化的精密调控。

虽然对突变特征的认识不断深入，但将这些模式与特定分子机制或内源性DNA损伤源联系起来仍然困难。例如，NER缺陷会导致在未暴露于紫外线辐射的组织中出现SBS8突变，但驱动这些突变的内源性损伤本质仍是未解之谜。同样，血液干细胞中的SBS19突变由未知来源的持续性内源性损伤驱动。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，Yang Jiang等研究人员深入探究了内源性DNA损伤、修复和耐受之间的复杂相互作用。为了揭示内源性DNA损伤的化学本质及其诱变机制，研究团队系统分析了TLS聚合酶Polκ缺陷小鼠多个组织的体细胞突变模式。

研究人员采用两种互补策略绘制小鼠组织体细胞突变图谱：一是通过类器官培养技术体外扩增单个细胞后进行全基因组测序；二是应用NanoSeq技术直接检测组织样本中的稀有突变。这些方法使团队能够全面评估不同器官中Polκ在塑造突变景观中的作用。

研究结果显示，Polκ缺陷小鼠肝脏和肾脏中点突变负担显著增加(4倍)，而在小肠和骨髓祖细胞中基本不变，表明Polκ的突变抑制作用具有组织特异性。研究人员发现了一个新型突变特征SBS-PolkKO，以C>A、C>G和C>T转变为特征，并具有强烈的转录链偏向性。这表明Polκ可能负责内源性鸟嘌呤加合物的无差错跨损伤合成。

通过转录链偏向性分析，研究人员推断驱动SBS-PolkKO突变的损伤是鸟嘌呤加合物，且是转录耦合修复的底物。为了验证这一假设，团队构建了Polκ与NER基因(Xpa、Xpc)双敲除小鼠。结果显示，NER缺陷部分增加了Polκ缺陷小鼠中的SBS-PolkKO突变负担，表明这些内源性鸟嘌呤损伤部分是NER的底物。令人惊讶的是，在完全缺失NER的Xpa^-/-Polκ^-/-样本中，SBS-PolkKO突变仍保留相当程度的转录链偏向性，提示可能存在非NER的转录耦合修复途径。

为了揭示驱动突变的内源性损伤的化学本质，研究人员采用质谱法定量分析了可能引发突变的DNA加合物。他们检测了三种N2-dG损伤：N2-丙烷-dG、N2-丙烯醛-dG和N2-乙烯-dG。结果发现，NER缺陷肾脏中N2-丙烷-dG和N2-乙烯-dG含量显著增加，表明这些损伤是体内NER的底物。

为了解Polκ在跨越这些损伤中的作用，团队使用非洲爪蟾卵提取物系统，研究了位点特异性N2-丙烷-dG和N2-丙烯醛-dG加合物的复制耦合绕过。在Mock耗竭提取物中，损伤绕过基本是无差错的(突变率1-2%)。而在Polκ耗竭提取物中，完全延伸产物的突变率增加(2-5%)，证实了Polκ在抑制这两种N2-dG加合物突变中的作用。

此外，研究人员采用非靶向DNA加合物组学方法，在NER缺陷肝脏中发现了7个未知加合物，其质量和碎片谱与较大的鸟嘌呤加合物一致，可能包括一些交联物。这些发现与NER修复庞大损伤的作用相符。

Polk抑制新型组织特异性突变特征

研究人员通过单细胞克隆扩增和NanoSeq两种方法，全面评估了小鼠组织的体细胞突变情况。发现Polκ缺陷小鼠肝脏和肾脏中SBS负担显著增加，而在小肠和骨髓祖细胞中基本不变，表明Polκ的突变抑制作用具有组织特异性。Signature分析揭示了一个新型突变特征SBS-PolkKO，该特征在Polκ缺陷小鼠的肾脏和肝脏样本中占主导。

小鼠组织中双碱基替换和插入缺失的突变景观

除了单碱基替换，研究人员还分析了双碱基替换(DBS)和插入缺失(Indel)。发现Polκ缺陷小鼠的肾脏和肝脏中DBS负担较高，表明Polκ可能通过促进内源性串联损伤的无差错绕过来抑制内源性DBS。Indel分析显示，Polκ缺陷小鼠各组织Indel负担与野生型相似，表明Polκ缺陷肝脏的诱变主要限于替换突变。

SBS-PolkKO突变以转录链偏向性为特征

对SBS-PolkKO突变拓扑特征分析发现，该突变特征具有强烈的转录链偏向性——在基因区域内，C>A、C>G和C>T突变在非转录链上明显少于转录链。这种偏向性可能源于转录耦合修复(TCR)，表明驱动SBS-PolkKO突变的内源性损伤也是TCR的底物，且很可能是阻塞转录的庞大损伤。

两条DNA修复通路保护肝脏免受SBS-PolkKO诱变

为了解SBS-PolkKO突变的起源，研究人员研究了NER对Polκ缺陷肝脏突变景观的影响。发现Xpc^-/-Polκ^-/-和Xpa^-/-Polκ^-/-双突变体肝脏的SBS、DBS和Indel负担均显著高于Polκ^-/-对照组。NER缺陷部分增加了Polκ缺陷小鼠中的SBS-PolkKO突变负担，表明NER是通过切除庞大鸟嘌呤加合物来抑制SBS-PolkKO诱变的修复通路。

Polk促进内源性dG加合物的复制耦合绕过

研究人员通过质谱法定量分析了小鼠组织中可能的DNA加合物，发现NER缺陷肾脏中N2-丙烷-dG和N2-乙烯-dG含量显著增加。使用非洲爪蟾卵提取物系统的实验证实，Polκ对于两种N2-dG加合物(N2-丙烷-dG和N2-丙烯醛-dG)的无差错绕过至关重要。在Polκ存在时，损伤绕过基本是无差错的；而Polκ耗竭导致突变率增加2-6倍。

通过非靶向DNA加合物组学鉴定新型内源性鸟嘌呤损伤

采用高分辨率LC/MS3加合物组学方法，研究人员在NER缺陷肝脏中发现了7个未知加合物，其质量和碎片谱与较大的鸟嘌呤加合物一致，可能包括一些交联物。这些新型内源性加合物可能是导致诱变的重要因素。

该研究系统阐述了内源性DNA损伤、修复和耐受之间的复杂相互作用。研究发现不仅揭示了一种新的诱变过程，还为理解癌症相关突变特征提供了关键机制见解。研究人员证明Polκ通过无差错绕过内源性鸟嘌呤加合物来抑制组织特异性突变，这种作用在肝脏和肾脏中尤为明显。同时，NER通路与Polκ协同作用，共同防止这些内源性损伤积累导致的突变。

值得注意的是，研究发现即使在完全缺失NER的Xpa^-/-Polκ^-/-小鼠中，SBS-PolkKO突变仍保留相当程度的转录链偏向性，这提示可能存在非NER的转录耦合修复途径，如TC-BER或TC-DPC修复。这一发现挑战了当前对转录耦合修复机制的理解。

研究还通过非靶向DNA加合物组学方法，在DNA修复缺陷背景下首次发现了7个新型内源性DNA加合物。这些加合物的结构鉴定及其诱变特性将是未来研究的重要方向。

总之，这项工作通过结合遗传学、基因组学、生物化学和DNA加合物组学等多学科方法，深入揭示了细胞如何通过精细调控DNA修复和损伤耐受机制来维持基因组稳定性，为理解内源性DNA损伤的生物学效应及其在衰老和癌症中的作用提供了新视角。研究展示的方法学框架也为未来探索其他类型内源性DNA损伤奠定了基础。