LRRC59与核转运蛋白协同调控核膜修复机制并守护基因组完整性

《Nature Communications》：LRRC59 cooperates with nuclear transporters to restrain the nuclear envelope repair machinery and safeguard genome integrity

本研究针对核膜（NE）破裂如何驱动基因组不稳定性与炎症这一关键科学问题，通过构建可诱导的CHMP7等位基因细胞模型，结合APEX2邻近标记蛋白质组学技术，系统绘制了NE修复相关蛋白质组（NE repairome），并鉴定出LRRC59是LEMD2-CHMP7区室化传感器的关键调控因子。研究发现LRRC59与核转运蛋白KPNB1和XPO1协同作用，将LEMD2-CHMP7复合物的组装限制在NE破裂部位，防止其过度扩散引发DNA扭转应力损伤。该工作揭示了NE修复的核心调控层，为理解癌症中基因组不稳定性机制提供了新视角。

　　

在细胞的生命活动中，细胞核如同一个精密的总指挥部，其外围的核膜（Nuclear Envelope, NE）则是保护遗传物质DNA的关键屏障。然而，这一屏障并非坚不可摧。在癌细胞迁移、病毒感染或机械压力等情况下，核膜会发生破裂，导致细胞核内外物质混合，引发基因组不稳定性、DNA损伤甚至炎症反应，这些都与癌症的发生发展密切相关。为了应对这一危机，细胞进化出了一套紧急修复系统，其核心是由内核膜蛋白LEMD2和ESCRT-III（内吞体分选复合物必需运输复合物-III）蛋白CHMP7组成的“区室化传感器”（compartmentalization sensor）。当核膜完整性受损时，原本局限于内质网的CHMP7会与内核膜上的LEMD2结合，进而招募下游的ESCRT-III machinery（如CHMP4B）来执行膜修复任务。尽管这一核心修复通路已被初步阐明，但关于其如何被精确调控以防止过度激活（尤其是在脆弱的微核中，过度激活的ESCRT-III反而会导致灾难性的DNA损伤）仍知之甚少。为了解决这一难题，由挪威奥斯陆大学的Coen Campsteijn教授领导的研究团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。

研究人员为了系统性地发现参与核膜修复的新调控因子，巧妙地构建了一套可控的研究系统。他们首先在人类视网膜色素上皮（RPE1）细胞中引入了可被强力霉素（Doxycycline, DOX）诱导表达的三种CHMP7变体：野生型（CHMP7^WT）、融合了核定位信号（NLS）的CHMP7^NLS以及核输出信号（NES）突变的CHMP7^NES*。这些变体可以分别模拟CHMP7在内质网或内核膜上的定位，从而可控地激活LEMD2-CHMP7传感器。在此基础上，他们又稳定表达了与工程化抗坏血酸过氧化物酶APEX2和荧光蛋白mCitrine融合的LEMD2或CHMP4B。APEX2能够在添加过氧化氢和生物素-酚（biotin-phenol）后，对周围约20纳米范围内的蛋白质进行生物素化标记。通过 streptavidin 富集这些被标记的蛋白质，并结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行定量分析，研究人员得以绘制出在CHMP7诱导下，围绕LEMD2和CHMP4B的“分子邻居”图谱，即核膜修复相关蛋白质组（NE repairome）。此外，他们还通过时间梯度诱导CHMP7^NES*，获得了修复复合物动态组装过程中的蛋白质组“快照”。这套组合技术方法的核心是利用可诱导的基因表达系统模拟核膜修复过程，并运用APEX2邻近标记技术进行高时空分辨率的蛋白质组学分析，从而无偏倚地鉴定与修复过程相关的蛋白质。

建立识别核膜修复调控因子的细胞系统

研究人员成功建立了基于RPE1细胞的模型系统，其中DOX诱导的CHMP7^NLS和CHMP7^NES*能有效在核膜上形成LEMD2-CHMP7-CHMP4B焦点，而CHMP7^WT则主要在内质网形成焦点。邻近生物素化标记和定量蛋白质组学分析证实，CHMP7的诱导表达是LEMD2与CHMP4B相互作用的必要条件，验证了该系统的可靠性。通过时间进程实验，他们发现CHMP7^NES*诱导后6-9小时，核膜破裂比例显著升高，此时LEMD2和CHMP4B的蛋白质组也显示出高度的重合性，表明修复复合物在功能位点上的有效组装。

邻近蛋白质组学揭示高度特异的核膜修复蛋白质组

通过对大量质谱数据的严格筛选，研究人员最终获得了一个包含110个核心蛋白的“NE repairome”列表。基因本体（GO）富集分析显示，这些蛋白显著富集在与核膜、内质网、ESCRT-III复合物以及膜重塑相关的条目中。蛋白互作网络分析进一步将这些蛋白聚类为核心ESCRT-III相关簇、内质网形态发生簇和肌动蛋白细胞骨架簇等。值得注意的是，通过比较CHMP7^NLS（核膜定位）和CHMP7^WT（内质网定位）条件下的蛋白质组，他们发现仅有3个蛋白（拓扑异构酶2B - Top2B、疫苗相关激酶1 - VRK1和ALYREF）被特异性富集在核膜修复焦点，提示局部染色质环境对修复蛋白质组的影响相对有限。时间进程分析则显示，包括ESCRT-III核心因子（如CHMP7, LEMD2, VPS4B等）以及内质网形态调控蛋白ATL3和LINC复合物组分Nesprin-1（SYNE1）在内的12个蛋白在CHMP7^NES*诱导后3小时即被显著富集，属于早期响应者。

LRRC59与LEMD2和CHMP7在INM和ER处发生关联

在筛选出的核心蛋白中，富含亮氨酸重复序列的蛋白LRRC59引起了研究人员的注意。它在CHMP7诱导后，在CHMP4B和LEMD2的邻近蛋白质组中分别呈现出超过1000倍和25倍的显著富集。免疫荧光和免疫印迹实验证实，内源性LRRC59在CHMP7^NES*表达后，会重新定位到CHMP4B、LEMD2和CHMP7聚集的焦点上。通过双分子荧光互补（BiFC）和邻近连接 assay（PLA）实验，他们证明了LRRC59与CHMP7以及LEMD2之间存在相互作用。结构域缺失实验发现，删除LRRC59面向内质网腔的短结构域（LRRC59^ΔLUM）会完全破坏其与CHMP7的共定位，但不影响LEMD2与CHMP7的相互作用。进一步地，在LEMD2敲低的细胞中，LRRC59向CHMP7^NES*焦点的募集被削弱。为了直接验证LRRC59与LEMD2通过其腔面结构域相互作用，研究人员构建了LRRC59与TurboID（一种生物素连接酶）的融合蛋白，使其活性中心朝向ER腔。 streptavidin 下拉实验结果显示，LEMD2被特异性生物素化并富集，而其他跨膜蛋白（如LBR）或核膜内侧蛋白（如Lamin A/C）则没有，确证了LRRC59与LEMD2通过其ER腔面结构域发生相互作用。

LRRC59调控核膜重构过程中的LEMD2积累

敲低LRRC59会导致RPE1细胞中出现富含LEMD2的核内陷和核内管状结构，这一表型与敲低CHMP7或CHMP2A（ESCRT-III的一个亚基）时观察到的现象相似。活细胞成像显示，在细胞有丝分裂退出、核膜重新形成的时期，LRRC59的缺失会导致LEMD2向新形成核膜的招募增加且滞留时间延长。这种LEMD2的异常富集在细胞进入间期后持续存在，并发展成核内管状结构，同时伴随核形态异常（如核疝）和核膜破裂频率的增加。特别是当LRRC59与核纤层蛋白Lamin B1同时被敲低时，会协同加剧核疝和NE破裂的发生。这些结果表明，LRRC59在有丝分裂后期的核膜重构过程中，对LEMD2的适时招募和后续的分散起着关键的调控作用。

LRRC59在间期核膜修复中调控LEMD2-CHMP7区室化传感器

研究人员进一步探究了LRRC59在间期核膜破裂修复中的作用。他们发现，敲低LRRC59会导致LEMD2和CHMP7在核膜破裂位点的积累显著增加且滞留时间延长。然而，通过监测mCherry-NLS（一种核定位信号标记的荧光蛋白）的核内再积累来评估核膜“修复”时，发现LRRC59敲低对修复半衰期没有显著影响。但mCherry-NLS的再积累可能反映的是核质运输的恢复而非膜的实际密封。因此，他们改用CHMP4B-mNeonGreen的招募动力学作为膜修复的直接指标。结果显示，尽管LRRC59敲低导致LEMD2-CHMP7传感器持续激活，但下游CHMP4B的招募和解聚动力学基本正常。与之相反，敲低CHMP2A（已知会阻碍ESCRT-III介导的膜裂变）则会导致CHMP4B在损伤位点被“困住”。这些数据表明，LRRC59的缺失主要影响的是LEMD2-CHMP7传感器的积累和解析，而不直接影响下游ESCRT-III的执行功能。这种调控依赖于LRRC59与LEMD2的相互作用，因为缺乏腔面结构域（LRRC59^ΔLUM）的突变体无法挽救LEMD2的动态异常。此外，LRRC59敲低还引起了细胞应激标志物p21的上调和增殖标志物Ki67、CCNB1的下调，说明其对细胞长期健康至关重要。

LRRC59、KPNB1和XPO1共同指导区室化传感器的组装

已知XPO1介导的核输出功能丧失（如CHMP7^NES*突变或使用抑制剂Leptomycin B, LMB）会促使CHMP7在核内积累并激活LEMD2-CHMP7传感器。本研究观察到，与CHMP7^NLS相比，CHMP7^NES*诱导产生的LEMD2焦点更大。用LMB处理CHMP7^NLS表达的细胞，也能模拟出类似的大LEMD2焦点，说明XPO1不仅调控CHMP7的定位，也影响其与LEMD2相互作用的程度。有趣的是，敲低LRRC59同样能增大CHMP7^NLS或CHMP7^NES*诱导的LEMD2焦点，且该效应与XPO1抑制（LMB处理）具有协同作用。蛋白质组学数据显示，核转运蛋白KPNB1（importin-β1）与LRRC59具有相似的募集动力学。细胞生物学实验证实，LRRC59含有一个经典的核定位信号（NLS），其核定位依赖于KPNB1，并且两者能发生物理相互作用。敲低KPNB1能模拟LRRC59敲低导致的LEMD2焦点增大表型，且两者同时敲低并无叠加效应，提示它们作用于同一通路。更重要的是，一个缺失NLS的LRRC59突变体（LRRC59^ΔNLS）不仅能挽救LRRC59敲低引起的LEMD2过度积累，甚至加速了LEMD2焦点的解析。分子建模分析提示，LRRC59的NLS紧邻其跨膜区和腔面区，当KPNB1结合在NLS上时，可能会在空间上阻碍LRRC59的腔面区与LEMD2相互作用。在核膜破裂处，RAN梯度消散，KPNB1无法从LRRC59上解离，从而可能持续抑制LRRC59对LEMD2的负调控功能，允许LEMD2-CHMP7复合物局部形成。而当LRRC59和XPO1的功能同时被破坏时，LEMD2会从最初的破裂点开始，像波浪一样沿着核膜迅速扩散，同时伴随有一波短暂的CHMP4B焦点在扩散前沿形成。这种LEMD2的扩散导致了DNA扭转应力标记物Top2B的显著富集，表明造成了基因组损伤。这些发现揭示了LRRC59-KPNB1和XPO1-CHMP7构成了两个互补的调控节点，共同确保LEMD2-CHMP7传感器的激活被严格限制在核膜破裂部位。

LRRC59控制微核的命运

微核（MN）由于其核质运输缺陷和核转运蛋白水平异常，极易发生核膜破裂且通常难以修复。本研究发现，LRRC59同样会募集到破裂的微核上。敲低LRRC59会加速并增强LEMD2向破裂微核的募集。一方面，这在一定程度上“平衡”了微核中原本可能失调的LEMD2/CHMP7比例，从而提高了部分微核的成功修复率；另一方面，在那些未能修复的微核中，LRRC59的缺失导致了LEMD2的过度积累和扩散，并伴随着DNA损伤标记物γH2AX的增加，加剧了基因组不稳定性。相反，过表达LRRC59则会降低微核的修复成功率。这表明LRRC59在微核的命运决定中扮演着复杂而关键的角色。

本研究通过创新的蛋白质组学方法，首次绘制了详尽的核膜修复蛋白质组图谱，并深入揭示了LRRC59与核转运蛋白KPNB1、XPO1协同构成的精细调控轴。该轴心通过限制LEMD2-CHMP7区室化传感器的活性范围，防止其过度激活引发的DNA损伤，从而在维护基因组完整性和细胞稳态中发挥至关重要的作用。这一发现不仅深化了对核膜修复分子机制的理解，更重要的是，为解释癌细胞中常见的核膜不稳定、基因组重排和炎症反应提供了新的理论框架。鉴于LRRC59在多种癌症中高表达且与不良预后相关，以及核转运抑制剂在癌症治疗中的广泛应用，本研究提示这些因素可能通过影响核膜（包括主核和微核）的修复能力，进而调控基因组不稳定性和癌症进程，为未来的癌症治疗策略提供了重要的新思路。