基于结构的环肽设计：靶向GPCR NTS1受体的功能性抗体开发新策略

《Nature Communications》：Structure-based design of macrocyclic peptides to generate functional antibodies against G protein-coupled receptors

本研究针对G蛋白偶联受体（GPCR）抗体开发困难这一长期挑战，提出了一种创新策略。研究人员通过计算机模拟设计能够模拟GPCR细胞外环三维结构的大环肽作为免疫原，并利用与哺乳动物遗传距离较远的鸡作为免疫宿主，成功开发出针对神经降压素受体1型（NTS1）的高特异性功能性抗体。研究结果表明，通过合理设计连接子实现的肽环化策略能够产生具有拮抗活性的抗体，为GPCR靶向治疗和诊断提供了新的技术路径，在癌症等疾病领域具有重要应用前景。

　　

在生物医学研究领域，G蛋白偶联受体（GPCR）家族作为最大的膜受体家族，一直是药物开发的重要靶点。这类受体在细胞生理学和体内平衡中发挥着关键作用，参与调控多种信号通路和细胞反应。然而，尽管目前市场上超过35%的批准药物针对GPCR，但针对这类受体的可靠抗体开发却一直面临巨大挑战。这主要是由于GPCR的免疫原性差、跨膜蛋白结构复杂以及物种间序列高度保守等因素造成的。

目前仅有三种抗GPCR抗体获得美国FDA批准，这凸显了开发此类抗体的技术难度。传统方法通常使用GPCR的N末端域或细胞外环作为免疫原，但难以模拟这些膜蛋白的天然构象。此外，GPCR的全面表达通常较弱且持续时间短，蛋白质可能错误折叠，细胞外表面表位可及性有限，这些都限制了抗体的开发效率。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，Marie-Edith Nepveu-Traversy等研究人员开发了一种创新策略，通过设计模拟GPCR细胞外环三维结构的大环肽作为免疫原，并利用与哺乳动物遗传距离较远的鸡作为免疫宿主，成功产生了针对神经降压素受体1型（NTS₁）的功能性抗体。NTS₁作为一种重要的GPCR，在多种人类癌症中过度表达，并与不良预后相关，因此成为理想的研究模型。

研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：基于分子操作环境（MOE）软件的计算设计和大环肽构象预测；分子动力学（MD）模拟和马尔可夫状态模型（MSM）分析；鸡免疫和卵黄抗体（IgY）提取纯化技术；以及包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫荧光、免疫印迹、免疫沉淀-质谱联用、生物发光共振能量转移（BRET）和放射性配体结合实验在内的多种抗体验证方法。研究使用了稳定表达HA标记的大鼠和人类NTS₁受体的HEK293A和CHO-K1细胞系，以及大鼠脑组织切片等实验材料。

理性设计和合成NTS₁第二细胞外环的肽模拟物

研究人员基于可用的NTS₁晶体结构，通过计算建模设计了模拟第二细胞外环（ECL2）结构的大环肽。他们评估了123种连接子，最终合成了三种构象受限的肽：3Dpeptide-1（侧链S-赖氨酸连接）、3Dpeptide-2（侧链S-鸟氨酸连接）和3Dpeptide-3（主链S-赖氨酸连接），同时合成了线性肽作为对照。

分子动力学模拟和构象分析显示，3Dpeptide-3具有最低的均方根偏差（RMSD）值（0.62 ?），且85.9%的预测构象状态与天然ECL2结构高度相似，表明其最可能模拟激动剂结合的rNTS₁受体中ECL2的三维结构。

抗NTS₁抗体的亲和力和选择性

通过鸡免疫产生的四种多克隆抗体（IgY-Lin、IgY-3D-1、IgY-3D-2和IgY-3D-3）均能有效识别其对应的肽抗原。竞争实验显示，针对3D肽的抗体对三维表位表现出显著特异性，其中IgY-3D-1显示出最高的特异性。丙氨酸扫描分析进一步证实了关键氨基酸残基在抗体结合中的重要性。

抗体验证：在细胞和脑组织中检测NTS₁靶蛋白

免疫荧光显微镜分析表明，IgY-3D-1和IgY-3D-3能有效检测固定细胞中表达的rNTS₁受体，并与HA信号高度共定位。特别值得注意的是，只有IgY-3D-3能够识别活细胞中的天然构象NTS₁。免疫组织化学分析进一步证实了这些抗体在大鼠脑组织中检测内源性rNTS₁的能力。

抗体验证：通过生化分析检测NTS₁

蛋白质印迹和免疫沉淀-质谱联用分析进一步验证了抗体的特异性。IgY-3D-1和IgY-3D-3能有效免疫沉淀NTS₁受体，质谱分析明确鉴定出来自Rattus norvegicus数据库的NTS₁C末端域肽段，证实了抗体与目标蛋白的特异性相互作用。

抗体功能特性

功能研究表明，IgY-3D-3能有效竞争性置换放射性标记的神经降压素（¹²⁵I-Tyr³-NT）与其配体结合位点的结合，IC₅₀值为3.2±0.7 μg/ml。通过BRET（生物发光共振能量转移）生物传感器分析，IgY-3D-3能有效阻断NT诱导的所有NTS₁信号通路，包括G蛋白（Gαq、Gαi2、Gα13、GαoB、Gαz）和β-抑制蛋白2信号通路，表现出完全的拮抗剂活性。

抗体交叉反应性和选择性

研究表明，IgY-3D-1能有效识别人NTS₁（hNTS₁）受体，而IgY-3D-3对人受体的识别能力较弱。两种抗体均能选择性识别rNTS₁，而不与密切相关的rNTS₂和rAPJ受体发生交叉反应，显示出良好的靶点选择性。

本研究成功开发了一种产生空间抗GPCR抗体的有效策略，通过计算指导的大环肽设计和鸡免疫系统相结合，解决了GPCR抗体开发中的关键难题。研究表明，连接子在肽环化中的关键作用决定了抗体是否能够发挥拮抗活性。IgY-3D-3表现出完整的拮抗剂特性，能够阻断G蛋白和β-抑制蛋白信号通路，而IgY-3D-1则显示出高度选择性特征，更适合诊断应用。

这项研究的重要意义在于为GPCR靶向治疗和诊断提供了新的技术平台。随着越来越多具有治疗意义的GPCR结构被解析，这种基于结构的抗体开发策略有望广泛应用于癌症、炎症、代谢和传染病等领域。此外，针对GPCR的抗体不仅可以作为治疗剂，还可以设计成包含效应器功能的形式，如抗体依赖性细胞毒性（ADCC）、抗体药物偶联物（ADC）或双特异性抗体，为精准医疗提供新的工具。

该技术平台的建立不仅解决了GPCR抗体开发的技术瓶颈，也为研究GPCR生物学和开发相关疗法提供了重要资源。通过结合计算生物学和实验验证，这种方法能够高效产生功能相关的抗体，大大降低了开发风险，为未来GPCR靶向治疗的发展奠定了坚实基础。