细胞内铜离子升高诱导CTR1单体化并阻断铜摄取的分子机制研究

《Nature Communications》：Elevated intracellular copper induces CTR1 monomerization and prevents copper uptake

本研究揭示了细胞内铜离子(Cu)稳态调控的新机制：为解决细胞如何快速响应高铜环境以防止毒性这一关键问题，研究人员聚焦于铜转运蛋白1(CTR1)，发现升高的细胞内Cu能诱导质膜上CTR1三聚体发生单体化，此过程依赖于功能性Cu摄取，并发生于Rab5+内吞区室，从而迅速终止Cu内流；该发现阐明了CTR1结构动态变化在Cu稳态精细调控中的核心作用，为相关疾病治疗提供了新靶点。

　　

铜是生命体必需的微量元素，参与线粒体能量产生、抗氧化防御等诸多关键生化过程。然而，细胞内铜水平必须被精确调控，因为一旦失衡，过量的铜就会产生毒性，导致细胞损伤乃至疾病发生。因此，细胞进化出了一套精细的机制来维持铜稳态。其中，铜转运蛋白1 (Copper Transporter 1, CTR1) 扮演着“守门人”的角色，它是细胞摄取铜的主要入口。以往的研究表明，当细胞外铜浓度过高时，CTR1会通过内吞作用从细胞膜上被移除，从而减少铜的进一步摄入。但是，细胞是如何在几分钟内快速启动这一“刹车”机制的？除了将CTR1从膜上清除之外，是否存在更快速的调控方式？这些关键问题长期以来悬而未决。

为了回答这些问题，由Meng-Hsuan Wen、Huanhuan Chen和Guangjie Yan作为共同第一作者，Tai-Yen Chen作为通讯作者的研究团队在《Nature Communications》上发表了一项突破性研究。他们发现，细胞内铜水平的升高会直接诱导CTR1发生一种此前未知的结构变化——从功能性的三聚体解离成单体。这种“单体化”发生在CTR1被内吞之前，能迅速关闭其铜转运活性，如同给铜摄入通道加了一道“分子锁”。这一发现揭示了细胞应对铜压力的一种快速、精准的防御策略。

研究人员综合运用了多种前沿技术。关键实验技术包括：单分子定位显微镜 (Single-molecule localization microscopy, SMLM) 和单分子邻近密度分析 (single-molecule neighbor density, smND) assay，用于在纳米尺度解析细胞内CTR1的寡聚化状态；分子动力学模拟 (Molecular Dynamics Simulations)，用于预测CTR1三聚体的稳定性及突变效应；电感耦合等离子体质谱 (Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry, ICP-MS)，用于精确测定细胞内铜含量；表面生物素化标记 (Surface biotinylation)，用于追踪CTR1的内吞过程。实验主要在购买的HEK293和COS7细胞系中进行。

计算结果提示CTR1三聚体稳定性与内吞可能存在关联

研究人员首先通过计算建模比较了野生型CTR1和内吞缺陷型突变体CTR1(M150L)。M150是CTR1选择性滤器中的一个关键甲硫氨酸残基。分析表明，M150L突变可能从两个方面影响CTR1功能：其一，该突变可能从物理上阻塞了中央的铜转运孔道；其二，更重要的是，计算预测该突变能显著稳定CTR1的三聚体结构，使其更难解离。这提示我们，M150L突变体之所以不能发生内吞，可能是因为其三聚体结构过于稳定而被“锁住”了。然而，这究竟是三聚体稳定直接导致的，还是因为该突变阻断了铜的摄入，使得细胞内缺乏触发内吞所需的铜信号？这需要通过实验来区分。

CTR1与mEos4b的融合蛋白保持正常功能

为了在细胞内原位、无扰动地研究CTR1，研究者巧妙地将一种光转换荧光蛋白mEos4b嵌入到CTR1的C末端，但特意保留了对三聚化至关重要的HCH基序，构建了CTR1mEos融合蛋白。验证实验表明，该融合蛋白具有与野生型CTR1相当的铜摄取能力和铜诱导的内吞活性，并且其寡聚状态也与野生型一致，确保了后续观察的真实性。

建立smND分析法区分蛋白质寡聚状态

本研究的关键创新在于开发并应用了smND分析法。该方法基于SMLM提供的超高精度（约20纳米）蛋白质定位信息，通过计算每个CTR1亚基周围40纳米范围内的“邻居”密度，来推断其寡聚状态（单体、二聚体、三聚体等）。研究人员用已知寡聚状态的膜蛋白（如Tac抗原）验证了该方法的准确性，并建立了两种三聚体解离的理论模型（Model 1: T→M+D; Model 2: T→3M）来估算三聚体比例的上限和下限，从而更精确地解析CTR1的动态寡聚平衡。

铜应激诱导表面CTR1mEos发生去三聚化

应用smND分析法，研究人员发现，在铜应激（100 μM CuCl₂处理15分钟）后，位于Rab5阳性内吞区域的CTR1，其寡聚状态发生了显著变化：三聚体比例从约63%下降至约42%，加权平均亚基数N也从2.30降至1.87。两种解离模型的分析均一致表明，铜诱导CTR1向单体形式转变。这种亚基间距离的增大（>40纳米）强烈提示发生了真实的解离，而非微小的构象调整。

CTR1(M150L)mEos突变体缺乏铜诱导的去三聚化和内吞

与野生型形成鲜明对比的是，内吞缺陷的CTR1(M150L)mEos突变体在应对铜应激时，其寡聚状态没有发生显著变化。同时，生化实验证实该突变体既不能有效摄取铜，也无法在铜刺激下发生内吞。这表明，M150位点的完整性对于铜诱导的CTR1去三聚化和后续内吞过程都至关重要。

铜应激选择性降低CTR1密度而不影响全局内吞

为了排除铜处理非特异性影响整个内吞机器的可能性，研究者进行了对照实验。他们发现，相同的铜处理条件并未引起通用内吞标记物WGA（小麦胚芽凝集素）内吞的增强，也未改变早期内吞标志蛋白Rab5在膜上的斑点数量和大小。这说明铜对CTR1内吞的促进作用是特异性的，而非全局性激活内吞。

细胞内铜触发区室特异性的CTR1解离以保障细胞存活

那么，是铜结合在M150位点本身触发了内吞，还是M150L突变体仅仅因为无法让铜进入细胞，从而缺少了必要的细胞内信号？为了回答这个关键问题，研究者使用了一种膜通透性的铜离子载体Cu-elasclomol (CuES)，它能绕过CTR1直接提升细胞内铜水平。有趣的是，对于CTR1(M150L)mEos，CuES处理能够成功引发其内吞。这证明，M150位点的核心功能是允许铜离子通透，而触发内吞的信号来自于细胞内升高的铜离子本身，而非该位点的直接感知。

进一步的空间分析显示，野生型CTR1的去三聚化主要发生在Rab5阳性的内吞区域，而在非Rab5区域变化不明显。这提示内吞 machinery的招募可能提供了促使三聚体解离的机械力或效应分子。最后，功能实验表明，当用Dynasore抑制内吞后，细胞对铜毒性的敏感性急剧增加，说明功能性内吞通路对于保护细胞免受急性铜毒性至关重要。

本研究结论和讨论部分归纳起来，提出了一个全新的CTR1调控模型：在基础状态下，CTR1以三聚体形式存在于质膜上进行铜转运。当细胞内铜水平升高至阈值时，会募集目前尚未明确的下游效应因子或内吞 machinery组件至CTR1的胞内区域（如YNSM基序），这种招募可能产生机械力或构象变化，促使稳定的三聚体解离成单体。单体化本身能快速中止铜转运，而随后的内吞则负责将无功能的单体从膜上清除，从而实现短期快速响应与长期适应性调节的协同。对于M150L突变体，由于铜转运被阻断，细胞内铜信号无法升高，内吞 machinery不被招募，三聚体因而保持稳定，内吞也无法发生。

这项研究的重要意义在于，它首次揭示了CTR1的寡聚化状态动态变化是其功能调控的一个核心环节。这种由细胞内铜浓度触发的、发生于内吞“热点”区域的快速去三聚化机制，为理解细胞如何快速应对金属离子应激提供了全新的视角。尽管研究中确认CTR1单体化是内吞的先导事件，但介导这一结构转换的具体分子玩家（如细胞内铜传感器或适配器蛋白）仍有待未来通过蛋白质组学或遗传学筛选等手段去发现。此外，本研究基于固定细胞样本的分析，未来开发活细胞实时成像技术以捕捉CTR1寡聚状态动态变化的动力学过程，将极大深化我们对这一精细调控网络的理解。总之，该研究不仅深化了对铜稳态基本规律的认识，也为与铜代谢紊乱相关的疾病（如威尔逊病、门克斯病等）的机制研究和治疗策略开发提供了新的思路。