固醇C4-甲基氧化酶Erg251调控白色念珠菌缺氧生长、定植与致病力的机制与靶向治疗潜力

《Nature Communications》：Sterol-C4-methyl-oxidase Erg251 governs Candida albicans hypoxic growth, commensalism and virulence

本研究针对白色念珠菌在宿主缺氧环境中生存和致病的机制尚不明确的问题，通过功能基因组筛选，发现固醇C4-甲基氧化酶Erg251是其在极端缺氧条件下生长、肠道定植和系统感染所必需的。研究揭示了Erg251通过低氧适应性酶学特性支持麦角固醇合成，其功能缺失或关键位点突变均削弱致病力。研究进一步证实选择性抑制剂PF1163A通过靶向Erg251在体外和线虫感染模型中展现出抗真菌疗效，为开发新型抗真菌药物提供了重要靶点和策略。

　　

在全球范围内，真菌病原体每年导致超过650万例危及生命的感染和250万人死亡。其中，白色念珠菌作为一种重要的人类共生菌，是系统性真菌疾病的主要贡献者。它通常存在于健康人体的微生物群中，定植于皮肤、胃肠道和生殖道等多种黏膜表面。然而，在免疫抑制或微生物群失调等条件下，它可以引发致命的系统性感染，死亡率高达50%，且现有抗真菌药物种类有限，耐药性日益严重，构成了巨大的公共卫生挑战。

肠道定植的白色念珠菌被认为是系统性感染的主要来源。在发病过程中，白色念珠菌能够穿越肠道屏障进入血液，导致播散性念珠菌病。在胃肠道内，白色念珠菌面临着复杂的环境，包括波动的pH值、营养可用性、宿主免疫压力、与其他共生菌的竞争，以及至关重要的缺氧条件。肠道内的氧气水平不均匀，范围从约0.04%到10%，甚至可降至接近零的水平。在系统性感染期间，白色念珠菌也需要在诸如肾髓质等低氧解剖部位逃避宿主免疫并持续存在。因此，白色念珠菌在常氧和缺氧生长之间切换的能力对于其在宿主体内的生存和定植至关重要。

先前的研究已经发现，低氧条件对白色念珠菌的代谢、细胞壁结构、形态以及对 antifungal 药物的敏感性具有广泛影响，并鉴定出一些参与低氧适应的关键转录调节因子。例如，在低氧条件下，转录因子Upc2会上调参与麦角固醇生物合成和铁获取的基因表达。尽管有这些发现，人们对白色念珠菌适应缺氧条件，尤其是极端缺氧条件的遗传和调控网络仍然知之甚少。

为了系统地揭示白色念珠菌在极端缺氧环境下的生存机制，研究人员利用GRACE（基因替换与条件性表达）突变体文库进行了大规模的功能基因组筛选。该文库包含超过3,200个白色念珠菌突变株。通过将突变株点在含有强力霉素的琼脂培养基上，并在无氧气体混合物（10% CO₂, 10% H₂, ~80% N₂）的密闭舱中培养，研究人员评估了每个突变株在极端缺氧条件下的生长情况。筛选结果鉴定出366个对EHC适应性重要的菌株（代表363个基因）。经过重点验证，最终确定了229个基因构成EHC适应性的核心必需基因集。进一步分析发现，绝大多数基因在常氧条件下也同样重要，仅有三个基因——ERG251（固醇C4-甲基氧化酶）、PDC11（丙酮酸脱羧酶）和ENT2（Epsin）——被特异性要求用于EHC下的生长。研究人员随后在原生营养型野生背景（SC5314）中构建了这些基因的纯合缺失突变体，证实了它们在EHC下的生长缺陷。

研究将焦点集中于ERG251，该基因编码固醇C4-甲基氧化酶，在麦角固醇生物合成途径中扮演关键角色。麦角固醇是真菌细胞膜的重要组成部分。Erg251与Erg26和Erg27协同，催化依赖于氧气的4,4-二甲基酵母固醇的两个C4甲基的去除。研究发现，无论是删除ERG251还是将其置于四环素可抑制的启动子（tetO）控制下进行条件性敲低，都会导致白色念珠菌在EHC下生长停滞，并伴随麦角固醇合成的显著减少和C4-甲基化固醇（如羊毛固醇、4,4-二甲基酵母固醇等）的积累。然而，在常氧条件下，ERG251的缺失或敲低并不影响麦角固醇的合成和菌株生长。这表明，白色念珠菌基因组中编码的另一个C4-甲基氧化酶——ERG25，能够在常氧条件下补偿ERG251的功能。事实上，在erg251缺失背景中敲低ERG25，会导致菌株在常氧条件下生长抑制和C4去甲基化受阻。相反，ERG25的缺失并不损害EHC下的生长，这强有力地证明Erg251是低氧 availability 下的主要C4-甲基氧化酶。

为什么Erg251在低氧环境下起主导作用？研究人员发现，与在充分通气琼脂上生长的细胞相比，在EHC下生长的细胞选择性地上调了ERG251的转录和蛋白表达，而ERG25的表达则相对较低。这种EHC依赖的ERG251诱导至少部分依赖于麦角固醇生物合成的主调控因子Upc2，因为破坏ERG251启动子中的Upc2结合共识序列会显著降低其诱导水平。有趣的是，即使利用ERG251的强启动子或不受抑制的tetO启动子过表达ERG25，也只能部分恢复erg251缺失菌株在EHC下的生长，并且C4-甲基固醇仍然积累。这表明，除了表达水平，Erg251本身可能具有更适应低氧环境的酶学特性。

这种对Erg251的依赖在其他致病性念珠菌物种中也显示出保守性。例如，在新兴病原体Candida auris（耳念珠菌）中，ERG251的缺失同样导致其在EHC下生长受损，而ERG25的缺失则影响较小，且C. auris的ERG251也在EHC下被诱导表达。

鉴于缺氧适应对白色念珠菌的致病性至关重要，研究人员评估了ERG251在毒力相关性状中的作用。他们发现erg251缺失突变体无法形成正常的生物被膜，而这种缺陷可以通过改善培养基的通气条件来挽救。在液体培养中，erg251突变体的稳健生长需要低培养体积和振荡以最大化氧气可用性，表明通气不足会严重损害其增殖能力。在小鼠系统性感染模型中，与野生型或回补对照菌株相比，感染erg251突变体的小鼠死亡显著延迟，感染早期肾脏和肝脏中的真菌负荷也更低，组织学分析显示肾脏中免疫细胞浸润减少。虽然突变体仍能形成菌丝，但其定植和扩散能力受损。此外，在稳定胃肠道定植的小鼠模型中，erg251缺失突变体在与回补菌株的竞争中被迅速淘汰，表明ERG251对于白色念珠菌在肠道这种低氧环境中的共生也至关重要。

为了深入解析Erg251适应低氧环境的结构基础，研究人员通过易错PCR对ERG251进行了随机突变，并筛选出在常氧下生长正常但在EHC下生长缺陷的突变体（称为BinGo突变体）。对这些突变体等位基因的测序和功能验证发现了一系列关键氨基酸残基，其中K93E、C108F、S248F、G251S和Y252N单个位点的替换就足以特异性损害EHC下的生长。利用AlphaFold3和TmAlphaFold预测的Erg251三维模型显示，这些突变位点富集在靠近双铁中心（特别是由四个组氨酸配位的Fe2）的胞质区域。将BinGo突变体（如K93E和Y252A）作为唯一的固醇C4-甲基氧化酶时，它们在常氧下功能正常，能合成ergosterol；但在EHC下，当野生型Erg251被敲低后，这些突变体则表现出C4-甲基固醇的积累。更重要的是，这些BinGo突变体在体外生物被膜形成、小鼠肾脏感染竞争以及胃肠道定植竞争中都表现出与erg251完全缺失突变体相似的毒力减弱表型。

研究人员推测，这些BinGo突变可能通过 destabilizing Fe2来影响Erg251功能。支持这一假设的是，在EHC培养基中补充高浓度的亚铁离子可以以剂量依赖的方式恢复BinGo突变体的生长。相反，铁补充并不能挽救erg251缺失突变体或ERG25过表达菌株在EHC下的生长缺陷。此外，作为唯一C4-甲基氧化酶的BinGo突变体对铁竞争剂（钴）或铁螯合剂（浴铜灵二磺酸钠，BPS）表现出超敏性，而ERG25过表达菌株则未显示此现象。这些遗传证据表明，BinGo突变干扰了Fe2的结合，这在氧气或铁 deprived 的条件下对Erg251功能是致命的。

最后，研究探讨了靶向固醇C4-甲基氧化酶的治疗潜力。已知的抑制剂PF1163A对Erg251显示出更强的抑制效果。机制上，PF1163A处理能快速诱导ERG251的转录上调，使其成为主要的靶标。过表达ERG25则能赋予菌株对PF1163A的抗性。对不同念珠菌物种同源基因的异源表达测试表明，PF1163A对Erg251同源物的抑制效果普遍优于对Erg25同源物。另一种结构不同的抑制剂1181-0519对两种酶的抑制效果差异较小，并且与PF1163A在双碟扩散实验中显示出协同抑制效应。在体外，低浓度的PF1163A（1μM）即可有效抑制白色念珠菌生物被膜的形成。在与表达荧光素酶的人HEK293T细胞或J774A.1巨噬细胞的共培养模型中，PF1163A能抑制真菌生长并挽救宿主细胞活力。虽然PF1163A因代谢稳定性问题未能在小鼠感染模型中测试，但在线虫感染模型中，PF1163A处理显著提高了感染白色念珠菌的Caenorhabditis elegans（秀丽隐杆线虫）的存活率，且无宿主毒性，证明了靶向固醇C4-甲基氧化酶策略的治疗前景。

为开展本研究，研究人员主要应用了以下关键技术方法：利用GRACE条件性基因失活文库进行大规模功能基因组筛选；采用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建基因缺失和定点突变菌株；通过气相色谱-质谱联用分析固醇组成谱；运用定点突变和异源表达评估基因功能保守性；建立小鼠系统性感染和胃肠道定植模型进行体内毒力评估；并使用线虫感染模型进行化合物疗效初步验证。

Erg251是白色念珠菌在极端缺氧条件下生长所必需的

通过功能基因组筛选，研究人员发现ERG251是少数几个特异性要求用于极端缺氧条件生长的基因之一。构建其纯合缺失突变体证实，该菌株在EHC下完全生长停滞，而这种生长抑制是氧气水平依赖性的。

Erg251是低氧环境下麦角固醇生物合成的主要C4-甲基氧化酶

条件性敲低ERG251导致EHC下麦角固醇合成严重受损和C4-甲基固醇积累，但在常氧下无此影响。相反，敲低ERG25会影响常氧下的生长和固醇合成，而不影响EHC生长。这表明在低氧下，Erg251承担了主要的催化功能。

ERG251的表达在低氧下被特异性诱导且部分依赖于Upc2

在EHC下，ERG251的转录和蛋白水平显著上调，而ERG25变化不大。这种诱导效应受到转录因子Upc2的调控。然而，即使过表达ERG25也无法完全补偿ERG251在EHC下的功能，提示Erg251具有内在的低氧适应性优势。

ERG251的功能在多种念珠菌病原体中保守

来自Candida dubliniensis、Candida parapsilosis和Candida tropicalis的ERG251同源物在C. albicans中能更好地支持EHC生长。在Candida auris中，ERG251的缺失同样导致EHC生长缺陷，且其表达受低氧诱导。

ERG251对于白色念珠菌的毒力和肠道定植至关重要

erg251缺失突变体表现出生物被膜形成缺陷，这与其在低氧液体环境中生长受损相关。在小鼠系统性感染模型中，该突变体毒力减弱，真菌负荷降低。在肠道定植竞争模型中，突变体被迅速淘汰，凸显了其适应宿主内低氧环境的能力对致病性和共生性的重要性。

随机突变筛选鉴定出破坏Erg251在EHC下功能的关键残基

通过易错PCR筛选，发现了多个导致"BinGo"表型（常氧正常、EHC缺陷）的ERG251突变等位基因。关键残基（如K93, Y252）位于预测的蛋白结构模型中靠近双铁中心Fe2的区域。

BinGo突变损害EHC下的固醇合成并减弱致病性

代表性的BinGo突变体（K93E, Y252A）在作为唯一C4-甲基氧化酶时，常氧下功能正常，但EHC下固醇合成受阻。这些突变体在生物被膜形成、小鼠肾脏感染和肠道定植方面均表现出毒力减弱。

BinGo突变可能通过 destabilizing Fe2来影响酶功能

亚铁离子补充能恢复BinGo突变体在EHC下的生长，且突变体对铁剥夺剂敏感，支持突变干扰了铁结合稳定性的假设。Erg25的功能则对铁 availability 不敏感。

固醇C4-甲基氧化酶是潜在的抗真菌靶点，抑制剂PF1163A显示出治疗潜力

抑制剂PF1163A对Erg251的抑制效果优于Erg25。PF1163A能有效抑制体外生物被膜形成，在共培养模型中保护宿主细胞，并在线虫感染模型中提高宿主存活率。其与另一种抑制剂1181-0519具有协同效应。

本研究通过系统的功能基因组学、生物化学、遗传学和体内感染模型，揭示了固醇C4-甲基氧化酶Erg251是白色念珠菌适应宿主内低氧环境的一个关键因子。研究阐明了白色念珠菌通过调控Erg251的表达和利用其独特的低氧适应性酶学特性，来维持其在缺氧条件下麦角固醇生物合成和细胞膜完整性的精细机制。ERG251的缺失或功能破坏显著削弱了白色念珠菌的毒力和定植能力，证明了缺氧适应在其致病过程中的核心地位。此外，研究不仅揭示了Erg251功能的结构基础，指出了双铁中心稳定性对其低氧活性的重要性，还验证了靶向固醇C4-甲基氧化酶，特别是Erg251，作为一种新型抗真菌策略的可行性。该研究为理解真菌病原体的环境适应机制提供了重要见解，并为开发针对难以治疗的念珠菌感染的新一代 therapeutics 指明了有希望的方向。