肠道细菌来源的鞘脂改变口服霍乱疫苗抗原的先天免疫反应

《Nature Communications》：Gut bacteria-derived sphingolipids alter innate immune responses to oral cholera vaccine antigens

本研究针对口服霍乱疫苗(OCV)保护效果存在个体差异的问题，通过宏基因组分析和体外实验验证，发现产生鞘脂的肠道细菌（如拟杆菌）可通过调节先天免疫反应增强OCV免疫效果，为改善疫苗效价提供了新策略。

　　

霍乱作为一种由霍乱弧菌引起的严重腹泻疾病，每年影响全球数百万人。尽管监测力度加大且安全用水措施不断推进，但霍乱在海地、黎巴嫩和叙利亚等地重新出现或爆发新疫情，同时在亚洲和非洲的50多个国家持续流行。口服霍乱疫苗(OCV)是控制霍乱的重要工具，但其保护期较短，且在5岁以下儿童中效果较差。

长期免疫保护机制尚未完全阐明。虽然较高的杀弧菌抗体滴度与疾病保护相关，但滴度在保护性免疫力消失前就会减弱。与自然感染不同，OCV仅在一半接种者中能刺激产生针对O特异性多糖(OSP)的记忆B细胞(MBC)反应，而OSP特异性MBC的存在与长期保护相关。尽管年龄等人口因素与疫苗反应可能性相关，但这些反应差异的生物学机制尚未明确。

近年证据表明，微生物群可能介导口服疫苗反应中一些无法解释的差异。肠道微生物群与其他口服疫苗反应存在关联，细菌性肠道过度生长接受者的OCV免疫反应降低，以及先前研究在独立队列中检测到肠道微生物群与OCV的OSP特异性MBC反应之间存在关联，这些都支持了肠道微生物群差异可能介导宿主对OCV反应差异的概念。

为了解接种时存在的肠道微生物如何影响宿主对OCV的反应，研究人员应用一种新的基因水平关联方法分析接种OCV时的微生物群宏基因组测序数据。这项研究旨在确定与感兴趣结果相关的特定微生物分离株，从而能够通过实验验证测序研究结果。

主要技术方法包括：在孟加拉国达卡招募89名参与者，收集接种OCV当天的粪便进行DNA提取和宏基因组测序；采用参考无关的基因水平方法进行共丰度基因(CAG)分组分析；通过靶向定量质谱进行粪便脂质组学分析；使用人THP-1巨噬细胞和外周血单核细胞(PBMC)进行体外免疫反应实验；通过RNA测序分析基因表达。

免疫反应与微生物群组成无关

研究人员将参与者根据疫苗接种前后MBC反应变化分为应答者(R)和无应答者(NR)。通过比较微生物分类多样性指标，发现疫苗应答者和无应答者之间的香农指数或Bray-Curtis群落结构无显著差异。稀疏曲线表明采样方法捕获了研究人群中的大部分细菌多样性。

共丰度基因群区分OCV应答者和无应答者的微生物群

为应对宏基因组数据的高维性并检查微生物群的详细特征，研究使用基因群作为基本分析单元。共丰度基因(CAG)可能编码在队列生物体共享的遗传元件上，以这种方式将基因分组已成功用于推断特定基因与生物学结果之间的关系。

研究确定了与MBC反应相关的CAG，错误发现率(FDR)调整q值≤0.1为预设显著性阈值。共鉴定4147个CAG，其中323个包含≥2个基因的CAG在四个疫苗反应指标中达到显著性阈值。大多数显著CAG映射到细菌基因组与IgA OSP特异性MBC反应相关，且大多数这些CAG与较高的免疫反应相关。

共丰度基因群与OCV反应的关联具有菌株特异性

由于CAG映射到多个参考菌株，研究为本次研究中检测到的每种细菌菌株分配了优先级评分。这一过程确定了与每种MBC反应相关的顶级细菌菌株，许多来自不同的分类群。通常，给定分类群中只有一小部分菌株具有高优先级评分，表明MBC反应与肠道微生物之间的关联可能是菌株特异性的。

在检测到的412个细菌属中，只有34个包含五个或多个映射到显著CAG的菌株。为证明同一物种内高优先级和无评分菌株之间的关系，研究人员确定了在研究人群粪便中检测到的Bacteroides xylanisolvens菌株，并利用NCBI基因组创建了系统发育树。分析确定的四个评分最高的B. xylanisolvens菌株在已知B. xylanisolvens总体种群中并不一致聚集，表明即使密切相关的菌株在基因内容上也存在足够差异，从而与不同的生物学效应相关。

疫苗应答者的微生物群以具有鞘脂产生潜力的细菌物种为特征

与OSP特异性IgA产生MBC反应相关的细菌菌株鉴定中，包含了能够产生鞘脂的属，如拟杆菌属和普雷沃菌属。这一发现引人注目，因为细菌很少产生自身的鞘脂，这些细菌来源的脂质由于其奇链结构而独特，与真核生物产生的偶链鞘脂形成对比。

由于鞘脂产生的代谢能力在拟杆菌属成员之间差异很大，研究人员使用CAG分析确定的菌株水平信息测量编码丝氨酸棕榈酰转移酶(spt)基因的生物体相对丰度，spt是微生物来源鞘脂从头组装所需的细菌酶。研究发现疫苗应答者粪便中拟杆菌spt丰度高于无应答者粪便。

通过靶向定量质谱基于脂质组学分析研究参与者粪便，发现几种鞘脂衍生物（包括神经酰胺）在疫苗应答者中更丰富。神经酰胺由鞘氨醇碱基和脂肪酸组成，细菌鞘脂源自这种神经酰胺骨架。因此，神经酰胺检测近似反映了鞘脂含量。

拟杆菌产生的鞘脂减弱人巨噬细胞的炎症细胞因子产生

由于先天免疫反应影响后续适应性免疫反应的发育，包括MBC的分化和增殖，研究人员接下来测试拟杆菌鞘脂是否在已建立的OCV反应人巨噬细胞模型中影响黏膜先天免疫反应。

研究首先从研究人群粪便分离株目录中选择了一个spt阳性Bacteroides xylanisolvens(Bx)菌株用于额外实验。生成在有或无spt抑制剂myriocin情况下培养的Bx裂解物，然后使用Bligh-Dyer方法分级分离裂解物以评估脂质或非脂质组分是否影响模型中的免疫反应。通过亲水相互作用液相色谱结合离子迁移质谱测量脂质组成和丰度，证实暴露于myriocin的Bx脂质提取物与未暴露于myriocin的Bx脂质提取物相比，神经酰胺丰度降低。

研究人员发现鞘脂还原(SL-reduced) Bx裂解物与未经处理的含鞘脂(SL-containing)裂解物相比，当应用于THP-1巨噬细胞时，白细胞介素-6(IL-6)产生显著减少。测试分级分离的Bx时，发现用Bx培养物的代谢物和非可溶性组分刺激的人巨噬细胞模型中的细胞因子反应在SL-reduced和SL-containing组分之间没有差异。测试SL-reduced和SL-containing脂质组分时，发现存在Bx鞘脂时IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和IL-8降低。暴露于Bx SL-reduced脂质的细胞产生的IL-6是暴露于SL-containing脂质组分的细胞的近6倍。

拟杆菌产生的鞘脂增加对霍乱弧菌抗原的先天免疫反应

研究人员观察到当Bx SL-reduced脂质提取物应用于人巨噬细胞时，先天细胞因子反应增加，这与先前发现一致，即疫苗无应答者的粪便提取物在该模型中增加了IL-6产生。

为测试这一点，研究人员用SL-reduced和SL-containing脂质组分预处理THP-1来源的人巨噬细胞，然后将它们暴露于热灭活的霍乱弧菌菌株JBK70（一种A-B毒素阴性疫苗菌株，作为OCV的替代物）。发现用SL-containing脂质组分预处理然后用JBK70刺激的巨噬细胞产生增加的IL-6和TNF-α。相反，用SL-reduced脂质组分预处理的巨噬细胞对JBK70的细胞因子反应较低。

为最小化非鞘脂脂质种类引起这种效应的可能性，研究人员接下来使用温和碱水解处理从脂质提取物中消耗磷脂。这种变化增强了巨噬细胞对鞘脂的反应，对JBK70刺激的IL-1β、IL-6、IL-12p40和TNF-α产生幅度进一步增加。为在研究人群中另一个spt阳性拟杆菌分离株中测试这种效应，研究人员选择了Bacteroides koreensis菌株，该物种被确定为与OSP特异性MBC OCV反应高度相关。使用该菌株重复了研究结果。

为进一步查询细菌鞘脂对人巨噬细胞的影响，研究人员对从用Bx SL-containing或SL-reduced脂质组分预处理（有或无暴露于热灭活JBK70）的THP-1巨噬细胞提取的RNA进行基因表达分析。使用基因集富集分析，发现与用SL-containing脂质预处理的细胞相比，在JBK70暴露前用SL-reduced Bx脂质预处理巨噬细胞增加了几个炎症通路的激活。

为识别在JBK70刺激后区分SL-reduced和SL-containing脂质刺激人巨噬细胞的免疫激活通路，研究人员重复分析以排除特定于热灭活JBK70且独立于细菌鞘脂暴露的基因表达。研究人员发现，与SL-reduced脂质处理后巨噬细胞反应相比，SL-containing脂质处理和JBK70刺激后的人巨噬细胞基因表达在TNF-α信号通过核因子κB(NF-κB)、IL-6-JAK-STAT3信号、炎症反应、上皮/间质转化和补体通路中富集。19个与富集通路差异相关的基因显示，其中几个基因与多个先天炎症通路相关。

最后，为在使用其他免疫细胞类型的THP-1巨噬细胞中验证研究结果，研究人员测试了有或无鞘脂暴露的OCV抗原在人外周血单核细胞(PBMC)中的效应。研究人员用B. xylanisolvens鞘脂组分预处理PBMC，并重复了JBK70刺激后IL-6增加的发现在某些供体中也重复了TNF-α增加的结果。这些数据共同支持了假设，即观察到的鞘脂产生细菌与人类疫苗反应之间的相关性可能部分归因于鞘脂驱动的对OCV抗原的先天免疫反应调节。

本研究通过接种时肠道微生物群的参考无关基因水平宏基因组分析，精确确定了可能控制肠道微生物与OCV反应性之间关系的特定菌株。研究结果强化了微生物群的个体差异驱动OCV反应变异的理念。由肠道微生物介导的基线先天免疫激活的修饰可能是改善OCV反应的新靶标，例如通过使用与OCV共同给药的益生元或益生菌产品。

这项研究的意义在于，它首次将肠道细菌来源的鞘脂与口服霍乱疫苗的免疫效果联系起来，并提出了一种通过调节微生物群来增强疫苗效价的新策略。在当前全球疫苗短缺和霍乱疫情增加的背景下，提高现有霍乱疫苗候选物的免疫原性将是一项关键进展。研究还展示了一种新的定量方法分析宏基因组测序数据，能够在无需参考基因组数据库或分类学的情况下识别与生物学结果相关的细菌菌株，这对于微生物组研究领域具有重要方法论意义。