HIV相关疼痛发病机制中特异性反应性星形胶质细胞亚群的鉴定及其Galectin-3依赖性作用

《Nature Communications》：Identification of a reactive astrocyte subpopulation during HIV-associated pain pathogenesis in mouse models

《自然-通讯》最新研究揭示，针对HIV患者常见并发症——病理性疼痛的机制不清难题，研究人员聚焦脊髓背角反应性星形胶质细胞，通过单核RNA测序技术在HIV-1 gp120转基因小鼠模型中鉴定出新型疼痛相关星形胶质细胞亚群（HIPA）。该亚群呈现吞噬和炎症相关转录特征，其形成依赖半乳糖凝集素-3（Galectin-3）表达。基因敲除实验证实Galectin-3通过调控HIPA影响机械性痛觉超敏，为HIV相关性疼痛提供了新的治疗靶点。

　　

当人类免疫缺陷病毒（HIV）感染者不仅需要对抗病毒本身，还要忍受难以缓解的慢性疼痛时，他们的生活质量会大打折扣。这种病理性疼痛是HIV感染者的常见并发症，然而其背后的发病机制却一直笼罩在迷雾之中。以往的研究发现，在出现神经病理性疼痛的HIV患者的脊髓背角（Spinal Dorsal Horn, SDH）中，反应性星形胶质细胞（reactive astrocytes）被选择性激活，暗示它们可能在疼痛的产生中扮演了关键角色。但是，这些反应性星形胶质细胞中，究竟是哪个特定的亚型直接导致了疼痛？这个问题一直没有明确的答案。

近日，发表在《自然-通讯》（Nature Communications）上的一项研究，成功拨开了这层迷雾。由Junying Zheng、Michael Spurgat、Shao-Jun Tang等研究人员组成的团队，在HIV相关疼痛的小鼠模型中，鉴定出了一个独特的反应性星形胶质细胞亚群。这个新发现的细胞群体，不仅具有特殊的分子标签，其形成和致病作用还依赖于一个名为半乳糖凝集素-3（Galectin-3, Gal3）的蛋白。这项发现为理解HIV相关疼痛的细胞机制提供了全新的视角，并指出了潜在的治疗新靶点。

为了开展这项研究，研究人员综合运用了多种关键技术。他们利用HIV-1 gp120转基因（gp120Tg）小鼠作为疾病模型，通过单核RNA测序（snRNA-seq）技术对小鼠腰椎脊髓细胞进行了高分辨率转录组分析，以鉴定细胞亚群。免疫荧光染色和共聚焦显微镜（包括ZEISS Airyscan超分辨率显微镜）被用于在组织原位验证和观察特定蛋白的表达与细胞形态。Imaris 3D图像分析软件则用于重构和定量分析细胞间的相互作用，特别是吞噬事件。此外，研究还采用了蛋白质免疫印迹（Western Blotting）来量化蛋白表达水平，RNAscope原位杂交技术用于在单细胞水平验证基因表达，并对来自美国国家神经艾滋病组织联盟（NNTC）的HIV感染者尸检脊髓组织进行了分析。行为学测试（如von Frey机械痛测试和Hargreaves热痛测试）则用于评估小鼠的疼痛行为。基因敲除（包括全身性敲除和星形胶质细胞条件性敲除）技术是验证目标分子功能的核心手段。

研究结果

鉴定出gp120转基因小鼠脊髓中特异性的星形胶质细胞亚群

为了深入探究HIV-1 gp120蛋白诱导疼痛的细胞机制，研究人员对4-5月龄的Gfap-gp120转基因（gp120Tg）小鼠的腰椎脊髓进行了snRNA-seq分析。通过对20,284个通过质控的细胞核进行UMAP聚类分析，他们绘制了详细的脊髓细胞图谱，并从中分离出星形胶质细胞进行亚群分析。分析结果揭示了8个星形胶质细胞亚群。通过比较野生型（WT）和gp120Tg小鼠的星形胶质细胞集群，研究人员发现了一个仅在gp120Tg小鼠中出现的全新亚群——第7簇。他们将这个亚群命名为HIV疼痛相关星形胶质细胞（HIV pain-associated astrocytes, HIPA）。HIPA占gp120Tg小鼠脊髓星形胶质细胞总数的20%。进一步分析显示，HIPA低表达与星形胶质细胞稳态功能相关的基因（如Gja1, Aqp4, Slc1a2），却高表达与炎症（如Gfap, Anxa3, Nox4）和吞噬作用（如Lgals3, C3）相关的基因。这表明HIPA可能是一类兼具炎症特性和吞噬能力的特殊星形胶质细胞。

Gal3是HIPA的特异性标志物

在HIPA中高表达的一系列基因中，编码Galectin-3（Gal3）的Lgals3基因的表达既高又具有选择性。因此，研究人员将Gal3作为HIPA的转录组学标志物。snRNA-seq数据显示，Gal3阳性的星形胶质细胞约占整个脊髓星形胶质细胞的6%，且主要富集于HIPA亚群中。为了验证这一发现，他们进行了Gal3与星形胶质细胞标志物GFAP、小胶质细胞标志物Iba1的共染色实验。结果证实，在gp120Tg小鼠脊髓中，Gal3几乎只表达于星形胶质细胞中，而不在小胶质细胞内，约95%的Gal3阳性细胞同时表达GFAP。这确认了Gal3是gp120Tg小鼠脊髓中HIPA的特异性标志物。

HIPA在脊髓中的分化

研究发现，在野生型小鼠脊髓中，Gal3蛋白低表达，且Gal3阳性细胞主要局限于中央管（Central Canal）区域的室管膜细胞。然而，在gp120Tg小鼠脊髓中，Gal3蛋白表达显著上调。更重要的是，Gal3阳性细胞的位置发生了明显变化：中央管区域的Gal3信号减少，取而代之的是大量Gal3阳性细胞出现在中央管之外的灰质中，特别是脊髓背角和腹角。这些细胞表达星形胶质细胞标志物GFAP，并呈现出从中央管向灰质外侧延伸的轨迹。此外，在gp120Tg小鼠的中央管室管膜层中，出现了GFAP阳性的细胞，这提示中央管区域的Gal3阳性室管膜细胞（已知的神经干细胞库）可能响应gp120信号，向星形胶质细胞谱系分化并迁移出去，最终形成HIPA。HIPA的形态也因其在脊髓中的位置而异：靠近中央管的HIPA体积较小，突起短，Gal3蛋白主要局限于细胞核；而远离中央管（如在背角）的HIPA则体积更大，形态更复杂，突起更多，Gal3蛋白分布于整个细胞。研究人员还在HIV感染者的尸检脊髓组织中观察到了Gal3蛋白和Gal3阳性星形胶质细胞的显著诱导，表明HIPA在人类HIV感染中同样可能被激活。

HIPA是神经元的吞噬细胞

由于HIPA高表达吞噬相关基因，研究人员推测其可能具有吞噬能力。通过Gal3与神经元核标志物NeuN的共染色，并结合Airyscan超分辨率显微镜3D成像和Imaris软件分析，他们获得了HIPA吞噬神经元胞体的直接证据。图像分析清晰地显示，完整的神经元胞体或碎片存在于HIPA内部。定量分析表明，在gp120Tg脊髓中，约有15%的Gal3阳性星形胶质细胞吞噬了神经元成分。同时，氟红C（Fluoro-Jade C, FJC）染色显示gp120Tg小鼠脊髓中退化神经元增加，且FJC信号与Gal3信号共定位，进一步支持了HIPA与神经元退化之间的关联。

Gal3基因敲除减少了gp120Tg脊髓中的HIPA

为了验证Gal3在HIPA形成中的作用，研究人员构建了gp120Tg/Gal3基因敲除（gp120Tg/Gal3^-/-）小鼠。snRNA-seq分析显示，在gp120Tg/Gal3^-/-小鼠的脊髓星形胶质细胞中，HIPA亚群（第7簇）几乎完全消失。同时，在gp120Tg小鼠中HIPA高表达的炎症和吞噬相关基因的上调，在Gal3敲除后也被显著抑制。这些结果强有力地表明，Gal3对于gp120诱导的HIPA的形成至关重要。

Gal3敲除减轻了gp120诱导的疼痛致病过程

最关键的问题是，HIPA以及Gal3是否参与疼痛行为？行为学实验发现，4-5月龄的gp120Tg小鼠表现出机械性痛觉超敏（mechanical allodynia）和热痛敏。全身性敲除Gal3或星形胶质细胞特异性杂合敲除Gal3，均能显著减轻gp120Tg小鼠的机械性痛觉超敏。此外，全身性Gal3敲除也能减轻热痛敏。这表明HIPA及其关键分子Gal3在HIV相关疼痛的发病机制中发挥重要作用。

那么，Gal3/HIPA是如何导致疼痛的？研究从多个角度进行了探究。首先，Gal3敲除阻止了gp120Tg小鼠脊髓中神经元退化（FJC信号增加）的发生，这与HIPA的吞噬功能相符。其次，Gal3敲除逆转了gp120诱导的神经炎症标志物的上调，包括成熟白细胞介素-1β（IL-1β）、Wnt5a蛋白和小胶质细胞标志物Iba1的水平。进一步机制探索发现，Gal3可能通过调控炎症小体（inflammasome）的活化（表现为活性caspase-1水平的变化）来影响IL-1β的成熟。这些结果提示，HIPA可能通过其吞噬作用导致疼痛环路中的神经退行性变，并通过释放炎症因子加剧神经炎症，共同促成疼痛的发生。

研究结论与意义

本研究通过先进的单核RNA测序技术，在模拟HIV相关疼痛的小鼠模型脊髓中，成功鉴定出一个新的反应性星形胶质细胞亚群——HIPA。该细胞亚群具有独特的炎症和吞噬相关转录特征，其形成严格依赖于Gal3蛋白。功能实验证明，敲除Gal3不仅能消除HIPA，还能有效缓解小鼠的疼痛行为、脊髓神经退行性变和神经炎症。此外，在HIV感染者的脊髓中也观察到了类似的Gal3阳性星形胶质细胞的增加，提升了研究发现的人类疾病相关性。

这项研究的发现具有多重重要意义。首先，它首次明确了一个特定的反应性星形胶质细胞亚型在HIV相关疼痛中的关键致病作用，将之前较为笼统的“反应性星形胶质细胞”概念具体化，推动了对疼痛细胞机制的精细理解。其次，研究将Gal3确立为HIPA的关键调控分子和潜在治疗靶点，为开发针对HIV相关慢性疼痛的新型镇痛策略提供了直接的理论和实验依据。最后，研究揭示的HIPA的吞噬神经元特性，为理解疼痛环路中神经元丢失的机制提供了新的视角，并且HIPA可能与神经系统其他疾病（如肌萎缩侧索硬化症）中的类似细胞或疼痛存在关联，拓宽了研究视野。未来，针对Gal3-HIPA轴的研究有望催生更具特异性和有效性的疼痛治疗方法。