基于基因必需性的蛋白质非共价套索纠缠错误折叠机制及分子伴侣差异性救援研究

《Nature Communications》：A widespread protein misfolding mechanism is differentially rescued in vitro by chaperones based on gene essentiality

本研究针对蛋白质错误折叠新机制，通过整合大肠杆菌蛋白质组范围有限蛋白酶解质谱数据与蛋白质天然结构数据集，揭示了非共价套索纠缠（NCLE）状态改变导致的错误折叠在数百种蛋白质中广泛存在。研究发现含天然NCLE的蛋白质错误折叠概率增加200%，且错误折叠偏好发生于NCLE区域。值得注意的是，分子伴侣DnaK和GroEL对必需蛋白的NCLE错误折叠具有特异性救援功能，其机制与必需蛋白NCLE环闭合接触较弱密切相关。该发现为理解蛋白质折叠质量控制提供了新视角，对疾病机制和衰老研究具有重要启示。

　　

在生命科学领域，蛋白质如何正确折叠形成功能性结构是半个世纪以来的核心课题。尽管蛋白质折叠研究已取得显著进展，但科学家们发现仍存在一类未被充分认识的错误折叠机制——非共价套索纠缠（NCLE）状态改变导致的错误折叠。这种机制最初于2022年通过分子模拟和生化实验提出，但缺乏大规模实验证据支持。NCLE包含三个关键要素：由残基间非共价接触闭合的骨架环、以及穿过该环的N端或C端片段。这种特殊的拓扑结构使含有NCLE的蛋白质面临着独特的折叠挑战：既可能无法形成天然NCLE，也可能形成非天然的NCLE，这两种情况都会导致蛋白质陷入长寿命的错误折叠状态。

传统观点认为，错误折叠的蛋白质通常会聚集、被降解或得到分子伴侣的协助重新折叠。然而，先前的研究发现，总有一部分错误折叠的蛋白质分子能够逃避这些质量控制机制，保持可溶状态但功能异常。这种现象提示我们，可能存在着一种更为隐蔽的错误折叠形式，而NCLE机制或许正是解释这一现象的关键。

为了探索这一假说，研究团队开展了创新性研究。他们巧妙地整合了高通量实验数据和计算生物学方法，对蛋白质错误折叠机制进行了系统解析。通过将大肠杆菌蛋白质组范围的有限蛋白酶解质谱（LiP-MS）数据与蛋白质天然结构数据集相结合，研究人员成功地在数百种蛋白质中检测到了NCLE错误折叠的特征信号。这种方法能够在残基水平上同时探测数百种蛋白质的非天然结构变化，为研究蛋白质错误折叠提供了前所未有的分辨率。

关键技术方法包括：有限蛋白酶解质谱（LiP-MS）技术用于在全蛋白质组范围内检测非天然结构变化；基于晶体结构和AlphaFold2预测结构的NCLE拓扑特征分析；分子动力学模拟研究NCLE错误折叠的分子机制；统计模型（如逻辑回归和LASSO回归）分析NCLE区域与错误折叠的关联性；以及 propensity score matching（倾向得分匹配）控制溶剂可及性等混杂因素。

蛋白质含天然NCLE的错误折叠概率增加200%

研究人员发现，含有天然NCLE的蛋白质出现错误折叠的概率是不含NCLE蛋白质的4.19倍（95%置信区间：2.32-7.57）。即使考虑了氨基酸组成和蛋白质长度等影响因素后，这一比值仍保持在3.06（95%置信区间：1.55-6.02）。这表明必须形成NCLE才能达到天然结构的蛋白质，在折叠过程中表现出非天然结构的可能性增加了206%。

NCLE区域的错误折叠偏好性提升40%

深入分析显示，错误折叠并非均匀分布在蛋白质的各个区域，而是显著集中在NCLE相关区域。与蛋白质的非NCLE区域相比，天然NCLE区域出现显著切割位点的相对风险增加了44%（比值比1.44，95%置信区间：1.31-1.59）。即使通过倾向得分匹配控制溶剂可及性差异后，这种关联性仍然显著（比值比1.38，95%置信区间：1.24-1.54）。

分子伴侣DnaK/GroEL的错误折叠校正具有选择性

研究发现，分子伴侣DnaK和GroEL并不能普遍纠正NCLE区域的错误折叠偏好。在必需蛋白中，GroEL显著降低了NCLE区域的错误折叠关联（ΔOR=-0.42，p=0.028），DnaK也表现出类似趋势（ΔOR=-0.35，p=0.070）。然而，在非必需蛋白中，这两种分子伴侣均未表现出显著的校正效果。

环闭合接触差异解释差异性救援机制

进一步分析揭示，非必需蛋白的NCLE环闭合接触中，芳香族-芳香族（F-F、F-Y）和芳香族-疏水性（S-Y、H-C）等强稳定性相互作用的比例显著高于必需蛋白。例如，F-F相互作用在非必需蛋白中的比例是必需蛋白的7.14倍。46.9%的纠缠非必需蛋白含有此类强稳定接触，而必需蛋白中仅有19.7%。这种能量学差异可能解释了分子伴侣为何能更有效地纠正必需蛋白的错误折叠—— reopening 稳定性较低的环闭合接触需要消耗的能量较少。

NCLE错误折叠的分子机制解析

分子模拟结果表明，NCLE错误折叠的主要机制是天然NCLE的缺失与非天然NCLE的获得之间存在结构性耦合。63.5%的错误折叠事件同时包含这两种变化，且61.4%的情况下，这两种变化涉及重叠的主链片段。这表明NCLE错误折叠是一个协同过程，而非独立事件。

研究结论表明，NCLE错误折叠可能是一种普遍存在的现象，其广泛性超出了先前的认知。分子伴侣对必需蛋白和非必需蛋白的错误折叠校正存在显著差异，这种差异主要源于两者NCLE环闭合接触的稳定性不同。该发现不仅为理解蛋白质折叠质量控制提供了新视角，也对疾病机制和衰老研究具有重要启示。由于NCLE错误折叠产生的结构变化较为细微，这类错误折叠蛋白可能更容易逃避细胞的质量控制系统，长期积累可能导致功能异常，进而参与疾病发生和衰老过程。

这项研究通过创新性地整合高通量实验数据和计算生物学方法，揭示了蛋白质错误折叠的新机制，为理解蛋白质稳态（proteostasis）调控提供了重要见解。该发现不仅拓展了我们对蛋白质折叠机制的认识，也为相关疾病治疗策略的开发奠定了理论基础。未来研究需要进一步探索这一机制在真核生物中的普适性，以及其在人类疾病中的具体作用机制。