基于糖蛋白稳定化与纳米颗粒展示联合糖基化修饰的下一代丝状病毒疫苗的理性设计

《Nature Communications》：Rational design of next-generation filovirus vaccines combining glycoprotein stabilization and nanoparticle display with glycan modification

本研究针对丝状病毒疫苗研发难题，通过理性设计策略将糖蛋白(GP)稳定化、纳米颗粒(SApNP)展示与糖基化修饰相结合，成功开发出针对埃博拉(EBOV)、苏丹(SUDV)、本迪布焦(BDBV)和拉文(RAVV)病毒的新型疫苗候选物。研究证实SApNP可显著延长淋巴结滤泡滞留时间达112倍，并诱导更强的生发中心反应，为广谱抗丝状病毒疫苗研发提供了新思路。

　　

丝状病毒是引起人类致命性出血热的重要病原体，其中埃博拉病毒(EBOV)和苏丹病毒(SUDV)等正埃博拉病毒属(Orthoebolavirus)成员，以及马尔堡病毒(MARV)和拉文病毒(RAVV)等正马尔堡病毒属(Orthomarburgvirus)成员尤为引人关注。尽管已有两种基于病毒载体的EBOV疫苗获批使用，但能够提供广泛保护作用的丝状病毒疫苗仍付之阙如。病毒表面的糖蛋白(Glycoprotein, GP)是介导宿主细胞附着和膜融合的关键蛋白，也是疫苗研发的主要靶点。然而，野生型GP存在高度不稳定性，其表面密集的糖基化修饰形成“糖盾”，可能遮蔽保守的中和抗体表位，影响疫苗效果。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，研究人员采用理性设计策略，开发了新一代丝状病毒疫苗。他们通过将GP稳定化、自组装蛋白纳米颗粒(Self-assembling Protein Nanoparticles, SApNPs)展示与糖基化修饰相结合，系统评估了这些策略对疫苗免疫原性的影响。

研究团队运用了多项关键技术方法：通过X射线晶体学和冷冻电镜(cryo-EM)解析GP原子结构；利用差示扫描量热法(DSC)评估蛋白热稳定性；采用负染电镜(nsEM)和动态光散射(DLS)表征纳米颗粒特性；通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和生物层干涉技术(BLI)分析抗原抗体结合活性；建立假病毒中和试验评估疫苗免疫血清的中和能力；利用免疫组织化学和透射电镜(TEM)研究疫苗在淋巴结中的分布和滞留情况；通过流式细胞术分析生发中心反应。

RESULTS

正埃博拉病毒GP稳定化的通用设计策略

研究人员将先前用于EBOV GP的稳定化策略成功扩展至SUDV和BDBV GP。通过引入HR1c弯曲区的脯氨酸突变(P2或P4)和HR2茎部的W615L突变，并添加C末端延伸，获得了稳定的GPΔmuc三聚体。3.2 ?的EBOV GPΔmuc-WL²P⁴晶体结构揭示了原子水平的细节，而3.13 ?的SUDV GPΔmuc-WL²P⁴/CA45复合物冷冻电镜结构显示了保守表位的识别机制。

理性设计的正埃博拉病毒GPΔmuc三聚体的结构表征

晶体结构分析发现，EBOV GPΔmuc-WL²P⁴中K95侧链与L573和T576骨架之间形成了分子间氢键，这些相互作用可能有助于增强三聚体的热稳定性。SUDV GP/CA45复合物的冷冻电镜结构揭示了抗体与GP2界面间的关键氢键网络，与EBOV GP/CA45晶体结构高度相似。

正埃博拉病毒GPΔmuc呈现纳米颗粒的理性设计与表征

研究人员对I3-01v9纳米颗粒支架进行N末端重新设计，优化了表面展示丝状病毒GP三聚体的能力。获得的六种SApNP构建体均显示出良好的组装特性，nsEM验证了其结构完整性。与可溶性三聚体相比，SApNPs表现出增加的寡甘露糖型糖基化比例。

糖基化修饰对正埃博拉病毒GPΔmuc三聚体和SApNPs的体外效应

研究发现，糖基化修饰对GP三聚体的热稳定性和抗原性影响有限。虽然Endo H处理降低了热稳定性，但增强了与某些广谱中和抗体(bNAbs)的结合。相反，kifunensine(Kif)处理产生的寡甘露糖富集型免疫原在小鼠中诱导了更强的抗体反应。

理性设计的预融合稳定化RAVV GPΔmuc三聚体

研究人员将类似的稳定化策略应用于RAVV GP，获得了有前景的三聚体构建体GPΔmuc-P²CT。该构建体显示出良好的热稳定性和抗原性，nsEM分析证实其呈现保守的NAb表位。

SUDV GPΔmuc三聚体和SApNPs在淋巴结中的分布和滞留

体内实验表明，与可溶性三聚体相比，SApNPs在淋巴结滤泡中的滞留时间延长约112倍，在滤泡树突状细胞(FDC)树突上的呈递量增加达28倍，并诱导了更强健的生发中心(GC)反应。

SUDV GPΔmuc SApNPs与FDCs和吞噬细胞在淋巴结中的相互作用

TEM分析显示，SApNPs被FDC网络捕获并在其树突上排列，有效与B细胞受体(BCR)交联。同时，SApNPs也被吞噬细胞内化，存在于内溶酶体中。

SUDV GPΔmuc三聚体和SApNPs在淋巴结中诱导的GC反应评估

SApNPs诱导了更强大、更持久的GC反应，GC/FDC比率和GC大小均显著大于可溶性三聚体组，且这种优势在免疫后8周内持续存在。

理性设计的丝状病毒GPΔmuc疫苗在小鼠中诱导的抗体反应

免疫原性评估显示，SApNPs疫苗诱导的结合抗体(bAb)和中和抗体(NAb)反应均强于可溶性三聚体。值得注意的是，RAVV GPΔmuc三聚体诱导了跨病毒属的中和反应，提示其作为泛丝状病毒疫苗组分的潜力。

糖基化修饰的丝状病毒GPΔmuc疫苗诱导的抗体反应

研究发现，Kif处理的寡甘露糖富集型免疫原诱导的抗体反应最强，而糖基修剪型免疫原的效果最弱，这一模式与HIV-1等疫苗研究中观察到的结果相反。

稳定化SUDV GPΔmuc三聚体诱导的性别依赖性抗体反应

女性小鼠对野生型和Kif处理的SUDV GPΔmuc三聚体均产生了更强的NAb反应，突出了性别在疫苗评估中的重要性。

研究结论表明，通过理性设计将GP稳定化、纳米颗粒展示和糖基化修饰相结合，能够显著提高丝状病毒疫苗的免疫原性。SApNPs通过延长淋巴结滞留、增强抗原呈递和促进生发中心反应，诱导了更强大、持久的抗体反应。虽然糖基化修饰的效果因病毒而异，但寡甘露糖富集策略在丝状病毒疫苗中显示出优势。该研究为开发下一代广谱抗丝状病毒疫苗奠定了坚实基础，尤其为应对未来可能出现的丝状病毒疫情提供了有价值的疫苗设计平台。