秀丽隐杆线虫BiP同源基因HSP-3和HSP-4功能分化调控蛋白质稳态、衰老与自噬的机制研究

《Nature Communications》：Functionally diversified Caenorhabditis elegans BiP orthologs control body growth, reproduction, stress resistance, aging, and autophagy

本研究针对内质网分子伴侣功能冗余与分化机制这一核心问题，系统揭示了秀丽隐杆线虫中两个内质网驻留HSP70家族伴侣蛋白HSP-3和HSP-4在应激抵抗、生长发育、繁殖、寿命和自噬调控中的独特作用。研究发现HSP-4通过IRE-1和Sec-62/C18E9.2调控自噬的新机制，并在人源细胞中验证了BiP-IRE-1-Sec-62信号轴在ER-phagy中的保守性，为理解分子伴侣功能分化如何优化生物体应激韧性提供了新视角。

　　

在真核细胞复杂的蛋白质折叠系统中，内质网作为蛋白质合成和折叠的关键场所，其稳态维持对细胞存活至关重要。内质网驻留的HSP70家族分子伴侣Binding Immunoglobulin Protein（BiP）在这一系统中扮演核心角色，它不仅能协助蛋白质正确折叠，还参与调控内质网未折叠蛋白反应（UPR^ER）和ER-选择性自噬（ER-phagy）。然而，一个令人困惑的问题是：在人类等高等生物中，单个BiP如何协调如此多样的功能？而秀丽隐杆线虫这一模式生物却拥有两个BiP同源蛋白HSP-3和HSP-4，这为研究分子伴侣的功能分化提供了独特窗口。

尽管早期研究提示HSP-3和HSP-4可能存在功能补偿，但越来越多的证据表明它们具有独特生物学功能。例如，HSP-4（而非HSP-3）在线虫发育过程中对角质层形成至关重要，暗示这两个高度相似的伴侣蛋白可能已经进化出特异化功能。然而，这两个旁系同源蛋白在机体生理学和应激抵抗中的具体分工以及其背后的分子机制尚不清晰。

为了解决这些问题，密歇根大学和范德堡大学的研究团队在《Nature Communications》上发表了题为"Functionally diversified Caenorhabditis elegans BiP orthologs control body growth, reproduction, stress resistance, aging, and autophagy"的研究论文。该研究系统阐明了HSP-3和HSP-4在时空表达、应激响应和生理功能上的异同，并揭示了一条由HSP-4/BiP通过IRE-1和Sec-62调控自噬的保守信号通路。

研究人员运用了多种关键技术方法开展研究：通过CRISPR/Cas9技术构建内源HSP-3和HSP-4荧光报告基因线虫株；利用RNA干扰进行基因敲低和组织特异性功能分析；采用免疫印迹、共聚焦显微镜和免疫共沉淀分析蛋白表达与相互作用；通过RNA测序进行转录组分析；利用瘫痪实验、寿命实验和生殖力评估等线虫表型分析；以及在A549人源细胞中进行机制验证。

HSP-3和HSP-4蛋白具有不同的表达谱

研究团队首先通过CRISPR/Cas9技术构建了HSP-3::wrmScarlet和HSP-4::wrmScarlet内源荧光报告株，发现两种蛋白的表达具有明显的时空特异性。HSP-3在幼虫发育阶段表达量较高，尤其在L3/L4期达到峰值；而HSP-4在早期成虫阶段表达最高。组织分布上，HSP-3在所有组织中均有较强表达，而HSP-4虽也广泛表达但水平较低，在受精囊中表达最为显著。

BiP同源基因显示不同的UPR^ER和内质网应激响应

研究人员发现两种蛋白对内质网应激剂的响应也不同：衣霉素（Tm）处理可上调HSP-3和HSP-4表达，而毒胡萝卜素（Tg）仅增加HSP-4水平。UPR^ER传感器中，IRE-1在基础条件和Tm诱导下对两种伴侣蛋白的表达均至关重要，而ATF-6和PEK-1对HSP-4的调控具有应激特异性。这些结果表明HSP-3和HSP-4受到差异化的转录调控。

HSP-3和HSP-4缺失引发不同的转录变化

RNA测序分析显示，hsp-3和hsp-4敲低引起部分重叠但 largely 独特的转录反应。hsp-3缺失主要上调蛋白质重折叠和小热休克蛋白相关基因，而hsp-4缺失则富集于内质网信号和应激响应通路。两者共同下调多种卵黄蛋白原基因，提示它们在生殖中的潜在作用。

HSP-4是繁殖力和身体生长所必需的

功能上，hsp-4敲低导致产卵量显著减少，卵黄蛋白组装异常，而hsp-3敲低仅引起产卵时间延迟。在身体生长方面，hsp-4缺失完全抑制了与年龄相关的体型增长，且这种效应不能被TGF-β配体DBL-1的过表达所挽救，表明HSP-4通过非经典途径调控体型。

年龄和组织特异性旁系同源基因表达影响寿命

寿命实验揭示了HSP-3和HSP-4的年龄和组织特异性需求：幼虫期hsp-3缺失或成虫期hsp-4缺失会缩短寿命。组织特异性敲低显示，肠道中hsp-4缺失导致母体裂解和早期死亡，生殖系中两种伴侣缺失均影响寿命，而神经元中仅hsp-4缺失缩短寿命。

HSP-4缺失改善蛋白质错误折叠诱导的瘫痪

令人意外的是，hsp-4敲低在多种蛋白质错误折叠模型（如Aβ_1-42、肌球蛋白突变等）中延缓了瘫痪进程，而hsp-3敲低则加重了某些模型的瘫痪表型，表明HSP-4缺失可能激活了保护性应激响应机制。

HSP-4敲低通过IRE-1增加自噬

机制上，研究人员发现hsp-4敲低显著增强自噬流，表现为GFP::LGG-1脂化和加工增加，而hsp-3敲低无此效应。这种自噬上调依赖于IRE-1，但不依赖于经典的XBP-1剪接信号，提示存在非经典IRE-1信号通路。

HSP-4敲低通过Sec-62/C18E9.2增强自噬

进一步筛选发现，ER-phagy受体C18E9.2/Sec-62是HSP-4调控自噬的关键介质。hsp-4与C18E9.2双敲低阻断了自噬上调，且C18E9.2是hsp-4敲低介导的蛋白质错误折叠抵抗和体型调控所必需的。

内质网应激改变人细胞中IRE-1和Sec-62的相互作用

在人源A549细胞中，研究人员验证了BiP-IRE-1-Sec-62轴的保守性。内质网应激后恢复期间，IRE-1与Sec-62的结合增加，而与BiP的结合减少，支持了"BiP从IRE-1解离后促进IRE-1与Sec-62相互作用"的模型。

本研究系统揭示了HSP-3和HSP-4在秀丽隐杆线虫中的功能分化：HSP-3主要承担经典的蛋白质折叠功能，而HSP-4更专注于调控器官间信号传导和应激响应通路。特别重要的是，研究发现了一条由HSP-4/BiP通过IRE-1和Sec-62调控自噬的进化保守通路，这为理解分子伴侣如何协调蛋白质折叠与降解提供了新视角。

该研究的创新性在于首次全面阐述了BiP同源基因的功能分化机制，并揭示了其在衰老和疾病相关蛋白毒性应激中的保护作用。这些发现不仅深化了对内质网蛋白质质量控制网络的理解，也为治疗与蛋白质错误折叠相关的神经退行性疾病和衰老相关疾病提供了新的潜在靶点。研究提示，针对特定BiP同源蛋白或其下游信号通路的精准调控，可能成为增强细胞应激韧性和延缓衰老相关病理过程的新策略。

值得注意的是，虽然本研究主要在线虫中进行，但在人源细胞中的验证实验表明这一调控机制在进化上具有保守性，增强了其生物学意义的普适性。未来研究可进一步探索HSP-3和HSP-4在特定组织和中不同应激条件下的动态相互作用，以及这一通路在哺乳动物疾病模型中的治疗潜力。