从不吸烟者肺癌微生物组大规模分析揭示临床相关性的缺失

《Nature Communications》：Microbiome analysis of 940 lung cancers in never-smokers reveals lack of clinically relevant associations

本研究针对肺组织微生物组研究规模小、结论不一致的问题，对940例从不吸烟者肺癌(LCINS)的4090份样本进行了16S、WGS和RNA-seq多组学分析。研究发现肺癌组织微生物生物量极低，且微生物组成/多样性与患者 demographics、临床特征、基因组改变及生存期均无显著关联。这表明在初治LCINS中，肺微生物组可能不扮演实质性角色。

　　

长期以来，科学家们对微生物在人类癌症中的作用抱有浓厚兴趣。然而，大多数癌症微生物组的研究焦点都集中在微生物丰度较高的器官，如口腔、胃和结肠。相比之下，对于肺部这类历史上曾被认为是“无菌”器官的微生物组研究则相对滞后。尽管基于痰液或支气管肺泡灌洗液(BAL)的研究挑战了肺部无菌的观点，并揭示了肺部微生物组与上呼吸道微生物的相似性，但直接对肺组织进行微生物组分析的研究规模普遍较小，且结果存在不一致。尤其值得注意的是，从不吸烟者肺癌(Lung Cancer in Never-Smokers, LCINS)的微生物组角色更是迷雾重重。一些小规模研究曾报告肺癌组织与癌旁正常组织之间存在微生物组差异，甚至暗示其与肿瘤临床特征相关，但这些发现亟需在更大规模、更严谨的研究中得到验证。

为了填补这一空白，由美国国家癌症研究所(National Cancer Institute)的Maria Teresa Landi领导的大型国际研究团队“Sherlock-Lung”开展了一项迄今为止规模最大的LCINS微生物组研究。该研究成果以《Microbiome analysis of 940 lung cancers in never-smokers reveals lack of clinically relevant associations》为题，发表在顶级期刊《Nature Communications》上。研究人员综合利用三种先进的测序技术——16S rRNA基因测序(16S)、全基因组测序(WGS)和RNA测序(RNA-seq)，对来自940名LCINS患者的4090份样本（包括肿瘤组织、癌旁正常肺组织和血液样本）进行了深入分析。尽管采用了最先进的分析方法和严格的质量控制，研究团队得出了一个令人惊讶的结论：在初治的LCINS中，肺组织微生物组并未显示出与患者 demographics（如年龄、性别、遗传背景）、临床特征（如肿瘤分期、组织学类型）、基因组改变或患者生存期之间存在具有临床意义的关联。

为开展此项研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术：首先，利用多中心合作收集了940例LCINS患者的肿瘤、癌旁正常肺组织及血液样本，构成了庞大的样本队列（Sherlock-Lung项目）。其次，对样本进行了16S rRNA测序、全基因组测序(WGS)和RNA测序(RNA-seq)三种不同类型的测序。再者，采用Kraken2和Bracken等生物信息学工具进行微生物分类学鉴定，并运用SCRuB等算法进行严格的去污染处理，以区分真实的微生物信号和实验污染物。最后，通过多样性分析、差异丰度分析、生存分析和基因组关联分析等多种统计方法，全面探究微生物组与各种临床、人口统计学和基因组特征之间的关系。

Description of study samples

本研究基于Sherlock-Lung项目，共分析了940名LCINS患者（女性740名，男性200名，中位年龄64.7岁）的样本。这些患者来自北美、南美、欧洲和亚洲等多个地区，具有多样的遗传背景（主要为欧洲和东亚 ancestry）。最常见的组织学类型是腺癌(n=811)。大多数肿瘤(n=522)和正常肺组织(n=278)样本同时拥有WGS、16S和RNA-seq三种测序数据，为多组学整合分析提供了坚实基础。

Multi-omic identification of bacterial reads

为了避免此前一些研究中将未比对上的宿主序列误认为细菌序列的错误，研究团队建立了一套严谨的分析流程。首先将所有测序读数与完整的人类参考基因组(CHM13 T2T)进行比对，过滤掉尽可能多的人类序列，然后将未比对的序列用于Kraken2进行微生物分类学鉴定。结果显示，在所有数据类型中，经过严格过滤后仍有许多未比对序列被归类为人类来源（中位数：RNA-seq 48.1%, WGS 6.4%, 16S 8.3%），这突显了在低生物量样本中区分真实微生物信号与背景噪音的挑战。在分类学已明确的非人类序列中，绝大多数是细菌。研究还对数据进行了批次校正和基于文献的去污染处理，以提升结果的可靠性。

The lung cancer microbiome has low biomass across all data types

分析显示，所有测序数据类型下的肺癌微生物组均表现出低生物量特征。16S测序样本的细菌读数最多（中位数：肿瘤730条，正常组织773条），这是由其靶向16S rRNA基因的特性决定的。RNA-seq样本的细菌读数居中（中位数：肿瘤9,080条，正常组织11,053条），而WGS样本的细菌读数最低（中位数：肿瘤344条，正常肺组织162条，血液1,440条）。与癌症基因组图谱(PCaWGS)计划中的其他癌症WGS数据相比，本研究中的LCINS样本显示出更低的细菌读数，这可能与DNA提取、测序方法差异以及吸烟状态不同有关。

Microbiome composition across tissue and data types

在微生物组成方面，变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)是 across all Sherlock数据集和样本类型中最丰富的门。在属水平上，不动杆菌属(Acinetobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)和链球菌属(Streptococcus)在所有三种数据集中均被检测到。值得注意的是，这些高丰度菌属与一项经过严格去污染的、包含245例肺癌（其中43例为从不吸烟者）的16S测序研究结果高度一致。比较肿瘤与正常肺组织的微生物组，16S数据中发现的差异丰度细菌在经过多重检验校正后均不显著，肿瘤样本的Alpha多样性（Shannon指数）仅略低于正常组织。RNA-seq数据则显示，正常组织中一些细菌（如棒状杆菌属、厌氧球菌属(Anaerococcus)等）相对富集，肿瘤组织的Alpha多样性也略低。然而，这些差异的效应值较小。

Microbiome characteristics in relation to demographic and clinical factors

研究人员广泛测试了微生物组特征（如Alpha多样性、Beta多样性、特定菌属丰度）与各种 demographic 和临床因素之间的关联。结果显示，在经过多重检验校正后，微生物组的Alpha多样性与年龄、性别、遗传背景、肿瘤分期、组织学类型等均无显著关联。Beta多样性分析表明，RNA-seq数据中微生物组成与肿瘤-正常状态、诊断年龄、组织学和生存状态存在微弱但显著的差异，但在16S或WGS数据中未观察到与临床 demographic 变量的显著关联。针对血液中循环细菌DNA的分析发现，厚壁菌门和变形菌门以及葡萄球菌属的丰度在肿瘤和配对血液样本中存在相关性，但血液微生物组的多样性或丰度与任何测试的临床特征（包括肺癌分期、组织学、复发风险或生存状态）均无显著关联。至关重要的是，利用三种测序数据进行的生存分析均未发现任何细菌属的相对丰度、丰富度或Alpha多样性与患者总生存期存在显著关联。即使将生存分析限制在肺腺癌患者中，结果亦然。效能计算表明，本研究有足够的统计效力检测到中等效应大小的关联，如果它们存在的话。

The microbiome is not associated with human genomic features

本研究的一个独特优势是拥有同一批样本的配套人类全基因组数据。研究人员借此探讨了微生物组特征与人类肺癌基因组中的主要驱动突变、融合基因、拷贝数变异、 kataegis（局部超突变）或突变特征之间是否存在关联。分析结果显示，在经过多重检验校正后，微生物组的丰富度或Alpha多样性与任何基因组特征之间均无显著关联。

DISCUSSION

综上所述，这项针对LCINS微生物组的迄今最大规模研究，通过整合16S、WGS和RNA-seq多组学数据，在超过4000份样本中观察到极低的微生物生物量，并且几乎没有发现证据支持肺癌微生物组的组成或多样性与LCINS的肿瘤特征、基因组特征和生存期存在关联。与基于BAL的研究通常报告口腔共生菌（如链球菌属、普雷沃菌属(Prevotella)）占主导不同，本研究中肺组织微生物组以不动杆菌属、棒状杆菌属、假单胞菌属和葡萄球菌属为主，这与近期一项经过严格去污染的肺组织微生物组研究结果一致。

本研究存在一些局限性，例如缺乏健康对照的肺组织样本，无法比较癌症患者与健康个体的肺部微生物组；研究提供的是肿瘤切除时微生物组的“快照”，且样本均来自未接受过治疗的患者，因此无法探讨微生物组对治疗反应的影响；WGS和RNA-seq数据集缺乏阴性对照，限制了污染物的精确识别，但作者指出不完全的去污染更可能导致假阳性而非假阴性结果。

尽管如此，每一项“阴性”结果都应被谨慎解读。随着适用于低生物量样本的细菌测序和微生物组分析方法的不断演进，未来或许能发现肺部微生物组在癌症中的某些作用。但就目前而言，在940名患者的4090份样本中应用多组学数据集、 rigorous 的质量控制和最先进的分析方法后，肺癌微生物组在初治的LCINS中似乎并不扮演主导性角色。这项研究为该领域提供了重要的基准数据，提示未来研究需要更加精细的实验设计和方法来探索微生物在特定肺癌亚型或特定环境下的潜在微妙作用。