基于质谱的单细胞组蛋白翻译后修饰分析揭示染色质异质性的新方法

《Nature Communications》：Mass spectrometry-based profiling of single-cell histone post-translational modifications to dissect chromatin heterogeneity

本研究开发了一种名为sc-hPTM的质谱分析方法，首次实现了单细胞水平组蛋白翻译后修饰(hPTMs)的无偏性分析。该方法成功鉴定67种组蛋白肽形式，包括H3K23su、H3K27hib等罕见修饰，并利用HDAC抑制剂处理证明其可区分细胞亚群、揭示hPTMs异质性响应及协同调控关系，为表观遗传异质性研究提供了强大工具。

　　

在生命科学领域，表观遗传调控如同细胞的身份密码，通过化学修饰在DNA和组蛋白上留下独特印记。其中，组蛋白翻译后修饰(hPTMs)构成了复杂的"组蛋白密码"，通过乙酰化(Ac)、甲基化(Me)、泛素化(Ub)和磷酸化(Ph)等修饰方式，调控染色质结构和基因表达。例如，组蛋白H4第16位赖氨酸乙酰化(H4K16ac)促进染色质开放和基因转录，而H3第27位赖氨酸三甲基化(H3K27me3)则与转录抑制相关。这些修饰的异常与癌症、神经退行性疾病等多种疾病密切相关。

然而，传统群体水平分析掩盖了细胞间的异质性，而现有单细胞表观基因组分析方法如单细胞染色质免疫沉淀测序，受限于抗体交叉反应性、空间位阻等问题。质谱分析虽能全面检测hPTMs，但单细胞水平的精准定量仍面临挑战。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，Ronald Cutler等研究人员开发了sc-hPTM方法，结合单细胞分选平台和新型质谱技术，实现了单细胞分辨率下hPTMs的高通量分析。该方法成功鉴定出67种组蛋白肽形式，覆盖25种独特修饰，包括近所有常见hPTMs，且重现性与传统群体实验相当。

关键技术方法包括：使用cellenONE平台进行单细胞自动分选和样品制备；优化组蛋白propionylation衍生化流程；建立基于Skyline的数据分析流程；采用DIA-PASEF质谱采集策略；利用组蛋白标准品区分技术噪音与生物变异；通过相关性分析揭示hPTMs协同调控网络。

方法开发与验证

研究人员建立的实验流程包括三个主要步骤：使用cellenONE仪器进行单细胞分离和样品制备、通过液相色谱-质谱联用技术(LC-MS/MS)获取组蛋白肽形式、利用Skyline和定制R脚本进行数据分析。该方法在单个细胞中稳定检测到67种组蛋白肽形式，技术重复的变异系数(CV)低于25%，与群体水平数据高度相关(R=0.94)。

定量准确性通过滴定曲线验证，显示大多数肽形式的MS1信号强度与细胞输入量呈良好线性关系。研究人员还建立了严格的质控标准，包括背景信号过滤、衍生化效率评估和批次效应校正，确保数据的可靠性。

HDAC抑制剂处理的单细胞hPTM分析

为验证方法实用性，研究人员用组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂钠丁酸盐(NaBut)处理HeLa细胞。主成分分析(PCA)显示处理组与对照组沿PC1明显分离，且与处理变量显著相关。通过训练k-近邻(KNN)分类器，成功将混合细胞群分类为对照组和处理组，准确率达84.21%。

差异分析显示，NaBut处理导致H2A、H3和H4的乙酰化肽形式显著增加，尤其是三乙酰化H4肽形式(H4K5acK8acK16ac和H4K5acK12acK16ac)。全局PTM分析证实乙酰化和单甲基化增加，而二/三甲基化减少，表明染色质开放状态。

细胞异质性与亚群分析

单细胞分辨率揭示了处理组内细胞的异质性响应。亚聚类分析识别出两个亚群：亚群A特征为H4尾部高乙酰化和H3K9acK14ac，与转录激活相关；亚群B则显示较低的H4乙酰化水平和较高的H3K9me3K14ac、H3K9me2，与转录抑制相关。这种异质性在群体分析中被掩盖，凸显了单细胞分析的价值。

hPTM协同调控网络分析

协方差分析揭示了hPTMs之间的调控关系。在对照组中，H3K18ac与多数二、三、四乙酰化H4肽形式正相关，而这些乙酰化修饰与H3K9me和H3K9me3K14ac负相关。NaBut处理后，协方差矩阵向正相关方向显著转变，表明HDACs在抑制hPTMs间正协调中发挥作用。

具体而言，H3K23ac与H3K14ac的相关性在处理组显著增强，而H4K5acK8acK12ac与H4K5ac的相关性减弱。这些发现通过流式细胞术验证，提示p300/CBP可能是这些位点的共同乙酰转移酶。

研究意义与展望

sc-hPTM方法实现了单细胞水平hPTMs的无偏、多重定量，填补了单细胞表观基因组学领域的关键空白。与抗体为基础的方法相比，该方法具有更高通量、更少交叉反应性，并能检测罕见修饰。未来应用包括研究细胞分化、疾病进展和治疗反应中的表观遗传调控。

技术进步方向包括：使用苯基异氰酸酯增强短肽检测、整合Gingipain酶改善疏水肽分析、应用同位素多重标记提高通量。这些发展将推动单细胞表观遗传学在基础研究和临床应用中发挥更大作用。

综上所述，这项研究建立的sc-hPTM方法为在单细胞水平解密"组蛋白密码"提供了强大工具，将深化我们对表观遗传异质性及其在生物学过程和疾病中作用的理解。