肝源性对氧磷酶1通过代谢重编程逆转调节性T细胞介导的免疫抑制抑制肝细胞癌进展

《Nature Communications》：Liver-specific paraoxonase-1 alleviates regulatory T cell-driven immunosuppression via metabolic reprogramming in hepatocellular carcinoma

本研究针对肝细胞癌（HCC）免疫抑制微环境中调节性T细胞（Treg）异常积聚的代谢调控机制，揭示了肝特异性蛋白对氧磷酶1（PON1）通过Von Hippel-Lindau蛋白（VHL）介导的低氧诱导因子1α（HIF-1α）泛素化降解，抑制乳酸生成，进而削弱Treg驱动的免疫抑制。研究证实PON1表达与HCC患者预后正相关，重组PON1蛋白及槲皮素增强PON1表达可协同抗程序性死亡蛋白1（PD-1）疗法抑制肿瘤进展，为HCC免疫治疗提供了新靶点。

　　

肝细胞癌（HCC）是全球第四大常见癌症和第三大癌症致死原因，尽管手术技术和靶向治疗、免疫治疗取得了显著进展，但仅有少数患者能获得持久的临床获益。免疫疗法在HCC治疗中显示出潜力，但其疗效受肿瘤微环境（TME）的免疫抑制特性限制。调节性T细胞（Treg）是肿瘤相关免疫抑制的关键调节因子，在HCC中浸润增加。不同的代谢程序，包括糖酵解、氧化磷酸化、脂肪酸氧化、脂肪酸合成和氨基酸代谢，及其关键调节因子，调节Treg细胞的增殖、迁移和功能。因此，阐明导致Treg细胞在HCC中积聚的代谢机制，对于逆转免疫抑制和开发更有效的免疫疗法至关重要。

对氧磷酶1（PON1）是一种主要在肝脏表达并分泌到血液中的糖蛋白，由于其抗氧化和抗炎特性，参与多种肝脏疾病。在慢性肝病患者中，PON1活性降低，低PON1水平与酒精性肝炎的严重程度呈负相关。升高的PON1表达通过抗氧化作用对非酒精性脂肪性肝炎（NASH）起到保护作用。通过生物信息学分析，PON1已被预测为HCC患者具有显著预后意义的肿瘤生物标志物。然而，从机制角度来看，PON1对HCC发展和免疫治疗的影响仍不清楚。

本研究旨在揭示PON1在HCC中的功能和潜在机制。研究人员通过分析癌症基因组图谱（TCGA）和基因型-组织表达（GTEx）数据库，发现PON1转录水平在HCC中显著下调。免疫组织化学分析显示，与瘤旁组织相比，肿瘤组织中的PON1蛋白水平显著降低。较高的PON1表达与HCC患者更好的总生存期和无进展生存期相关。为了研究PON1在HCC进展中的作用，研究人员构建了稳定过表达Pon1（Pon1-OV）和敲低Pon1（Pon1-KD）的Hepa1-6细胞，并建立了小鼠HCC模型。Pon1过表达抑制了原位和皮下肿瘤的生长，而Pon1敲低则促进了肿瘤生长。在免疫缺陷Rag-1^-/-小鼠中，Pon1-OV和对照细胞产生的皮下肿瘤进展无差异，表明PON1介导的肿瘤抑制根本上依赖于免疫调节。

为了探索PON1在抗肿瘤免疫应答中的潜在功能，研究人员对HCC样本进行了细胞类型识别通过估计RNA转录本相对子集（CIBERSORT）分析。结果显示，在TCGA-LIHC队列中，高PON1 HCC肿瘤中的Treg细胞显著减少。对20例中山医院HCC组织的分析表明，PON1低表达组的Treg细胞频率高于PON1高表达组，且PON1表达与Treg细胞比例呈负相关。对皮下肿瘤免疫图谱的解码显示，与对照组相比，Pon1-OV组Treg细胞减少，CD8⁺T细胞的抗肿瘤反应增强；而Pon1-KD组Treg细胞浸润显著升高，CD8⁺T细胞的抗肿瘤反应降低。体外共培养实验表明，Hepa1-6细胞中Pon1过表达损害了CD4⁺T细胞向Treg分化的能力，而Pon1敲低则促进了Treg分化。更重要的是，通过抗CD25抗体（aCD25）耗竭Treg细胞，消除了Pon1过表达介导的抗肿瘤效应，并逆转了Pon1敲低诱导的促肿瘤效应。这些结果确定PON1以Treg依赖性方式发挥抗肿瘤作用。

鉴于PON1是肝脏特异性基因，研究人员接下来试图确定参与PON1介导的肿瘤细胞与Treg之间相互作用的关键因子。采用数据非依赖采集（DIA）的定量蛋白质组学应用于Pon1-NC和Pon1-OV Hepa1-6细胞。差异表达蛋白的京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析显示代谢通路显著富集。基因集富集分析（GSEA）也显示，与糖酵解、柠檬酸循环、碳代谢和氨基酸合成相关的基因在Pon1-OV皮下肿瘤中减少。靶向代谢组学鉴定出36种在两组间存在显著差异的代谢物，其中有机酸水平在Pon1-OV肿瘤中显著降低，乳酸含量最高，且在Pon1-OV组中水平较低。Pon1过表达减少了乳酸积累，而Pon1敲低则产生相反效果。在HCC患者中，PON1表达与乳酸水平呈负相关，而乳酸水平与Treg细胞比例呈正相关。体外实验表明，Pon1-OV细胞细胞外酸化率（ECAR）降低，Pon1-KD细胞ECAR升高。乳酸脱氢酶A（Ldha）敲低显著抑制了Treg细胞的生成。单细胞测序显示，在Pon1-KD皮下肿瘤中，外周诱导的Treg（pTreg）相对于胸腺来源的Treg（tTreg）选择性扩增。体内瘤内乳酸注射促进了HCC肿瘤生长并伴随Treg细胞浸润增加，且乳酸消除了PON1在HCC中的肿瘤抑制功能。这些数据证明乳酸是PON1介导的肿瘤细胞与Treg细胞之间相互作用的代谢信使。

随后，研究人员旨在阐明PON1调节乳酸产生的分子机制。亚细胞分级分离和共聚焦显微镜显示PON1主要定位于细胞质。差异表达蛋白的亚细胞定位分析也确定细胞质为主要区域。进一步分析发现，控制乳酸生成的主要转录因子HIF-1α是PON1的潜在靶标。Hepa1-6细胞中Pon1过表达减弱了HIF-1α蛋白水平，而Pon1敲低则使其升高，但Pon1表达变化对Hif-1α mRNA表达无影响。在缺氧条件下，Pon1过表达增加了HIF-1α的泛素化，而Pon1敲低则抑制了HIF-1α泛素化。这些结果表明PON1通过促进HIF-1α蛋白泛素化来损害乳酸生成。

VHL已被报道调控HIF-1α蛋白的降解。免疫荧光实验揭示了PON1、VHL和HIF-1α在Hepa1-6细胞中的共定位。共免疫沉淀（co-IP）实验显示了PON1、VHL和HIF-1α之间的内源性相互作用。谷胱甘肽S-转移酶下拉（GST pull-down）实验证实了PON1与VHL之间的直接相互作用。这些数据表明PON1通过招募VHL与HIF-1α结合来促进HIF-1α泛素化和降解。研究人员进一步研究了VHL在PON1介导的抗肿瘤效应中的作用。Vhl敲低（Vhl-KD）通过抑制HIF-1α泛素化促进了乳酸生成，而Pon1过表达未能逆转Vhl敲低引起的HIF-1α积累和乳酸分泌增加。Vhl-KD组表现出显著增强的Treg细胞浸润和肿瘤体积，且在Vhl-KD背景下Pon1过表达（Vhl-KD+Pon1-OV）不影响Treg细胞浸润或肿瘤生长。值得注意的是，Vhl敲低不影响PON1的分泌或活性（内酯酶功能），而Pon1过写则升高了这些参数。这确定了PON1的肿瘤抑制功能需要直接与VHL结合，并且独立于其分泌特性和内在酶活性。此外，通过VHL依赖性蛋白酶体途径降解HIF-1α的LW6给药，逆转了Pon1敲低诱导的肿瘤生长，同时伴随乳酸产生减少和Treg细胞浸润降低。这些结果证明PON1通过VHL-HIF-1α-乳酸信号轴调节HCC中Treg介导的免疫抑制。

为了进一步评估PON1在HCC进展中的潜在临床价值，研究人员用重组PON1蛋白（rPON1）处理荷瘤小鼠。rPON1显著抑制了肿瘤生长，伴随乳酸水平降低和Treg细胞比例减少。rPON1不影响Hepa1-6细胞的增殖。此外，在用抗CD25抗体耗竭Treg的小鼠中，rPON1的抗肿瘤作用被消除。某些药物、膳食因素和生活方式因素被报道刺激Pon1转录激活。结果显示槲皮素以剂量依赖性方式上调Pon1 mRNA表达。为了探索槲皮素诱导Pon1上调的机制，研究人员分析了暴露于10μM槲皮素的Hepa1-6细胞中Pon1调节转录因子（PPARγ、JUN、NF-κB、SP1、SREBP2和AHR）。槲皮素显著上调了Pparg和Jun的表达。双荧光素酶报告基因实验证明，Jun和Pparg的表达质粒均激活了Pon1转录。然而，只有PPARγ拮抗剂T0070907消除了槲皮素诱导的Pon1上调。随后，研究人员评估了槲皮素单药治疗及其与抗PD-1疗法协同组合在HCC中的疗效。在槲皮素给药后，观察到肿瘤生长抑制、乳酸水平降低和Treg细胞百分比降低。槲皮素在体外高浓度下抑制Hepa1-6细胞增殖。此外，槲皮素的抗肿瘤作用在Treg细胞耗竭的小鼠中被消除。令人惊讶的是，抗PD-1和槲皮素的联合治疗导致肿瘤生长相比单药治疗组显著延迟。这些结果表明槲皮素抑制HCC生长，并在我们的模型中与免疫检查点阻断（ICB）协同作用。这表明提高PON1水平是HCC一种有前景的治疗策略。

本研究揭示了PON1在缓解免疫抑制方面一个先前未被认识的代谢功能。PON1通过破坏乳酸生成减少HCC中Treg细胞浸润，从而抑制肿瘤生长。研究人员还阐明了PON1-VHL-HIF-1α轴在小鼠HCC细胞系和小鼠模型中乳酸生成的机制。然而，考虑到我们模型的局限性，PON1-VHL-HIF-1α轴在人类HCC中的功能需要通过临床相关的人源化平台进一步验证，特别是双人源化患者来源异种移植模型和患者来源类器官。基于此处提供的数据，我们认为提高PON1水平可以消除乳酸诱导的免疫抑制，这是HCC一种潜在有效的治疗选择，也是ICB联合治疗最受青睐的策略之一。

关键技术方法

本研究综合利用生物信息学分析（TCGA、GTEx、GEO数据库）、免疫组化、小鼠肿瘤模型（皮下、原位移植及 hydrodynamic 尾静脉注射模型）、流式细胞术、蛋白质组学（DIA质谱）、靶向代谢组学、体外共培养、免疫共沉淀、泛素化分析、Seahorse细胞能量代谢分析、单细胞RNA测序及体内药理学干预（如重组蛋白rPON1、槲皮素、抗PD-1抗体）等技术。临床样本来源于中山医院队列（包括组织芯片和新鲜肿瘤组织）。

研究结果

PON1抑制HCC生长并与更好预后相关

PON1在小鼠和人类肝脏中特异性表达。生物信息学分析和免疫组化证实PON1在HCC中表达下调，且较高PON1表达与患者更好预后相关。小鼠模型中，Pon1过表达抑制肿瘤生长，而Pon1基因缺失加速肿瘤进展。

Treg细胞减少对PON1介导的HCC进展抑制至关重要

PON1过表达不影响体外细胞增殖，但在免疫缺陷小鼠中无抗肿瘤效应，表明其作用依赖免疫调节。高PON1表达HCC中Treg细胞比例降低，CD8⁺T细胞功能增强。体外共培养证实PON1调控CD4⁺T细胞向Treg分化，体内Treg耗竭实验证明PON1抗肿瘤效应呈Treg依赖性。

乳酸是PON1调控Treg细胞浸润的关键代谢物

蛋白质组学和代谢组学显示PON1过表达导致代谢通路重编程，乳酸水平显著降低。PON1表达与患者肿瘤乳酸含量负相关，乳酸水平与Treg比例正相关。体外外源性乳酸促进Treg分化，体内乳酸注射逆转PON1的抗肿瘤作用。

PON1通过VHL介导的HIF-1α泛素化破坏乳酸生成

PON1促进HIF-1α蛋白泛素化降解，而不影响其mRNA表达。PON1与VHL、HIF-1α存在相互作用，招募VHL介导HIF-1α降解。VHL敲除后PON1过表达无法逆转乳酸生成和肿瘤生长，证实PON1作用依赖VHL通路。

提升PON1水平是HCC有前景的免疫治疗策略

重组PON1蛋白治疗抑制肿瘤生长并降低Treg浸润。槲皮素通过激活PPARγ上调PON1表达，与抗PD-1疗法协同增强抗肿瘤疗效。

结论与意义

本研究首次揭示肝特异性蛋白PON1通过VHL-HIF-1α-乳酸轴调控肿瘤代谢微环境，逆转Treg介导的免疫抑制，抑制HCC进展。不仅阐明了PON1作为代谢免疫检查点的功能机制，还验证了其作为治疗靶点的可行性（如rPON1、槲皮素联合免疫治疗），为HCC的代谢-免疫联合治疗提供了新策略。论文发表于《Nature Communications》，对肝癌免疫治疗领域具有重要理论和临床意义。