DNA甲基化谱揭示冠心病不良预后的新型生物标志物及FKBP5的关键机制

《Nature Communications》：DNA methylation predicts adverse outcomes of coronary artery disease

本研究针对冠心病（CAD）患者不良预后预测难题，通过多中心队列分析血液白细胞DNA甲基化谱，发现70个与死亡风险相关的差异甲基化位点（DMPs），其中FKBP5基因相关位点通过调控炎症反应和细胞衰老通路驱动疾病进展。研究人员构建的10-DMPs联合临床特征预测模型（AUC=0.83）显著优于传统临床模型，并通过动物实验证实Fkbp5基因敲除可改善心肌梗死小鼠心功能。该研究为CAD精准预后评估提供了新型表观遗传学工具。

　　

冠状动脉疾病（CAD）是全球范围内导致死亡的主要原因之一，尽管在过去30年中，对其临床风险因素的管理以及二级和三级预防取得了显著改善，但CAD每年仍导致1780万人死亡。除了死亡率之外，其他主要不良心血管事件（MACE），如心肌梗死（MI）、中风和血运重建，给医疗系统带来了沉重负担。识别预后不良风险较高的患者，可以实现更密切的医疗监护，从而获得更好的临床结局机会。大量基于遗传学的研究报道了预测CAD患者不良结局的新靶点和工具。然而，疾病向哪个方向发展是由遗传和环境因素共同作用决定的，因此，研究人员认为，综合考虑多层面信息，如遗传学和表观遗传学，将能更好地识别易发生不良预后的患者。

DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰，反映了遗传易感性和环境暴露的共同作用，并在多种疾病的发生和发展中发挥作用。表观基因组关联研究（EWAS）表明，DNA甲基化可作为CAD的可行生物标志物。最近的大规模EWAS调查了不同祖先群体的多个队列，共同报道了血液白细胞中85个与CAD或MI发病相关的DNA甲基化位点。此外，初步的EWAS研究还发现了与心血管疾病全因死亡相关的强信号，尽管其生物学机制仍有待探索。因此，DNA甲基化不仅指示CAD的发病风险，也预示其进展。

为了深入探究DNA甲基化在CAD预后预测中的作用，研究人员在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。他们旨在发现可作为CAD预后预测生物标志物的差异甲基化CpG位点（DMPs），并揭示驱动CAD进展的分子机制。

本研究采用了多中心两阶段设计。研究人员从中国一家医疗中心招募了5000多名CAD患者并进行医疗结局随访，从中通过巢式病例对照研究设计筛选出405名患者组成发现集。在长达13年的随访期间，记录了217例死亡。验证集则从中国两家地区的三家医疗中心招募了528名CAD患者。在入组后约三年内，记录了25例死亡。在两个研究集中，研究人员在入组时（基线）采集血液样本，使用Illumina Infinium MethylationEPIC 850K BeadChip芯片分析了血液白细胞的DNA甲基化谱。经过严格质控，在发现集中获得733,737个高质量CpG探针，在验证集中获得738,366个探针。随后，通过基于COX生存模型的EWAS分析，并校正性别、年龄、吸烟状态、经皮冠状动脉介入治疗、心力衰竭、高血压、心律失常、高脂血症、2型糖尿病和用药等协变量，初步在发现集中鉴定出333个与死亡相关的DMPs。其中大多数为高甲基化。值得注意的是，54%的DMPs在EWAS Catalog和EWAS Atlas中有记录，与多种性状和疾病相关。在验证集中，有70个DMPs被成功复制，且效应方向一致。特别值得注意的是，映射到FKBP5（FK506结合蛋白5）基因的两个DMPs（cg25114611和cg25563198）与CAD死亡风险显著相关。

对70个DMPs的基因组特征分析发现，它们显著富集于增强子等基因调控元件，特别是在血液单核细胞、脂肪细胞、心肌等CAD相关组织和细胞类型特异的调控区域。通过注释最近的基因，研究人员揭示了69个预后基因，这些基因在信号转导磷酸化、应激反应、凋亡等通路中富集。此外，这些DMPs与炎症标志物（如全身免疫炎症指数SII、纤维蛋白原FIB、血小板淋巴细胞比率PLR）和左心室功能（如左心室射血分数LVEF）显著相关。特别值得注意的是，27%的DMPs与高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）水平显著相关，且关联方向与死亡风险相反，这与HDLC在心血管结局中的保护作用一致。

研究人员还探讨了遗传变异对DNA甲基化的调控，发现76%的DMPs与东亚人群中的甲基化数量性状位点（meQTL）存在关联。为了验证DMPs对基因表达的影响，研究人员进行了表达数量性状甲基化（eQTM）分析，发现54.4%的DMPs与其邻近基因的表达水平相关，其中多数呈负相关。FKBP5的两个DMPs的甲基化水平与FKBP5的表达呈负相关。对已发表转录组数据的分析证实，FKBP5在MI和中风患者的外周血中表达显著上调，并且在MI进展过程中，心脏组织的几乎所有细胞类型中FKBP5均上调。

鉴于FKBP5在CAD预后中的关键作用，研究人员通过构建Fkbp5基因敲除（KO）小鼠模型，进一步研究了其在MI中的作用。结果显示，在野生型（WT）小鼠中，MI/R手术显著上调了Fkbp5的表达。敲除Fkbp5对假手术组小鼠的心功能没有影响，但在MI/R模型中，敲除Fkbp5发挥了保护作用，显著改善了左心室射血分数（LVEF）和左心室缩短分数（LVFS），减小了梗死面积，并降低了炎症标志物PLR。这些结果证实了FKBP5在MI中的关键作用。

基于研究结果，研究人员利用随机生存森林算法和COX回归，构建了CAD死亡的预后模型。仅包含10个DMPs的模型（CG模型）的曲线下面积（AUC）为0.71。当结合年龄和性别后，模型AUC提升至0.79。进一步整合纤维蛋白原（FIB）、HDLC和LVEF等临床特征构建的集成模型（Ensemble model）AUC达到了0.83，显著优于仅基于临床特征的模型。该集成模型在独立的验证集中也能良好地区分患者风险，并且能够识别经历过血运重建、中风和心肌梗死等严重不良事件但存活下来的CAD患者，表明其确实捕捉到了预后的本质信号。

研究人员还比较了多种DNA甲基化时钟模型与他们的预后模型的预测性能，发现尽管一些时钟模型表现相当甚至更好，但它们的CpG位点数量远多于本研究简洁的10个位点模型，表明本研究的预后模型更具特异性和临床转化潜力。

本研究的主要技术方法包括：采用多中心巢式病例对照研究设计，招募中国CAD患者队列并进行长期随访；使用Illumina Infinium MethylationEPIC 850K BeadChip进行全基因组DNA甲基化 profiling，并进行严格的质控和标准化处理；通过表观基因组关联研究（EWAS）鉴定与死亡相关的差异甲基化位点（DMPs）；利用随机生存森林和COX比例风险回归构建预后模型；通过生物信息学分析（如基因组注释、富集分析、染色质互作ABC模型、eQTM分析）阐释DMPs的生物学功能；查询公共数据库（如EWAS Catalog、Roadmap Epigenomics、meQTL数据）进行验证和功能探索；利用已发表的转录组数据和单细胞RNA测序数据验证关键基因表达；并通过Fkbp5基因敲除小鼠模型进行心肌缺血/再灌注（MI/R）实验，结合超声心动图、Evans Blue/TTC染色等技术验证FKBP5的功能。

结果

基线特征

发现集和验证集的基线特征分析显示，死亡组患者年龄更大，阿司匹林使用率较低，天冬氨酸氨基转移酶（AST）和肌酐水平较高。

与CAD预后相关的差异甲基化CpG位点

通过EWAS分析，在发现集中鉴定出333个与死亡相关的DMPs，其中70个在验证集中得到复制。这些DMPs富集于CAD相关组织和细胞类型的调控区域，并与炎症、心脏功能和HDLC等表型相关。

DMPs推断的通路和中介表型

70个DMPs注释到的69个预后基因在炎症反应、细胞衰老等通路中富集。DMPs与血小板相关炎症指标（SII、FIB、PLR）、HDLC以及左心室功能（LVEF、LVMI）显著相关，提示血栓性炎症和心脏收缩功能障碍介导了CAD的不良结局。

遗传调控对DNA甲基化的贡献

76%的DMPs与东亚人群中的meQTLs存在关联，表明这些DMPs受到显著的遗传调控。例如，靠近AUTS2基因的cg16500036与超过1000个meQTLs相关。

DNA甲基化对基因表达的贡献

eQTM分析显示，37个DMPs与其邻近基因表达相关。FKBP5的两个DMPs（cg25114611, cg25563198）的甲基化水平与FKBP5表达呈负相关。公共转录组数据证实FKBP5在MI和中风患者外周血以及MI心脏组织中表达上调。

Fkbp5下调改善左心室功能并减轻炎症反应

动物实验表明，Fkbp5基因敲除对假手术小鼠心功能无影响，但在MI/R模型中，敲除Fkbp5可显著改善LVEF和LVFS，减小梗死面积，并降低炎症指标PLR，证实了FKBP5在心肌损伤中的关键作用。

CAD死亡预后模型

基于10个DMPs、性别、年龄、FIB、HDLC和LVEF构建的集成预后模型在发现集中AUC达到0.83，显著优于临床模型。该模型在验证集中显示出良好的风险分层能力，并能预测非死亡性MACE。

讨论与结论

本研究通过对933名中国CAD患者血液白细胞进行DNA甲基化分析，建立了强大的预后预测模型，并揭示了FKBP5等关键基因在CAD进展中的重要作用。研究发现，DNA甲基化标志物与血小板参与的炎症、左心室功能和HDLC密切相关，提示早期血栓性炎症和心脏功能不全是CAD不良结局的重要介质。值得注意的是，DMPs与HDLC而非其他脂质强相关，表明胆固醇清除能力可能比其积累对CAD预后更为相关。

70个复制的DMPs中有76%位于增强子附近，与基因表达（特别是早衰和炎症相关基因）紧密相关。这些DMPs显示出细胞类型特异性，并富集于心脏特征区域。此外，DMPs受到显著的遗传调控，类似于复杂性状的多基因模型。

在鉴定的69个预后基因中，FKBP5和AUTS2等基因在不良事件发生时表达变化显著，并在多种分析中反复出现作为最重要的发现。FKBP5是一种免疫亲和蛋白，其表达改变与炎症和心脏功能相关。本研究和已有证据均支持这些预后基因在CAD进展中扮演重要角色。

本研究存在的局限性包括随访时间可能偏重于中短期预后，甲基化数据的批次效应限制了样本合并分析的能力，验证集死亡病例数相对较少可能影响统计效力，以及小鼠完全基因敲除模型与人类队列中观察到的适度表观遗传下调存在差异。尽管如此，基因敲除小鼠的保护表象为FKBP5下调与心肌损伤改善之间的机制联系提供了汇聚证据。

总之，本研究展示了利用外周血DNA甲基化预测CAD患者未来不良事件的价值。研究结果不仅为CAD预后评估提供了新的表观遗传学生物标志物和预测工具，也为深入理解CAD进展的分子机制，特别是FKBP5通路的作用，提供了重要线索，为后续开发新的治疗策略奠定了基础。