高脂饮食下调RKIP通过破坏PC/PE-ER稳态驱动MASLD的新机制

《Nature Communications》：Diet-induced RKIP downregulation disrupts PC/PE-ER homeostasis to drive MASLD

本研究针对高脂饮食（HFD）如何引发代谢相关脂肪性肝病（MASLD）的机制不明问题，揭示了肝细胞中Raf激酶抑制蛋白（RKIP）下调是关键环节。研究人员发现HFD通过诱导内质网应激，抑制RKIP的S-棕榈酰化修饰，促进其经ERAD途径降解；RKIP缺失会损害磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶（PEMT）的m6A依赖性翻译，导致磷脂酰胆碱（PC）/磷脂酰乙醇胺（PE）比率失衡、内质网应激和脂质积聚，从而驱动MASLD进展。该研究阐明了HFD-RKIP-PEMT轴在肝脏代谢稳态中的核心作用，为MASLD防治提供了新靶点。

　　

随着全球肥胖率的持续攀升，代谢相关脂肪性肝病（MASLD）已成为最常见的慢性肝病，影响着约三分之一的人口。这种疾病谱系广泛，从单纯的肝脏脂肪变性（MASL）可进展为代谢相关脂肪性肝炎（MASH）、肝纤维化、肝硬化，甚至肝细胞癌（HCC），严重威胁人类健康。目前，尚无获批用于治疗MASLD的特效药物，深入理解其发病机制对于开发新的治疗策略至关重要。

不健康的饮食习惯，特别是高脂饮食（HFD），已被确认为MASLD明确的风险因素。过量的脂肪酸被运送至肝脏，给肝细胞的内质网（ER）——这个负责脂质合成和蛋白质折叠的关键细胞器——带来了巨大压力。内质网应激在MASLD从脂肪变性到HCC的整个进程中扮演着核心角色。在肝细胞的内质网膜上，磷脂酰胆碱（PC）和磷脂酰乙醇胺（PE）是最主要的磷脂成分，维持适当的PC/PE比率对于内质网膜的稳定至关重要。研究表明，MASLD患者和小鼠模型中均存在肝脏PC/PE比率降低的现象，这种失衡会诱发内质网应激，促进肝脏脂肪变性和炎症。然而，脂肪酸究竟如何导致PC/PE比率失衡，其背后的分子通路至今仍未完全阐明。

Raf激酶抑制蛋白（RKIP），也称为磷脂酰乙醇胺结合蛋白1（PEBP1），是细胞内多种信号通路（如Raf/MEK/ERK、NF-κB）的重要调节因子。既往研究发现，RKIP在炎症和抗病毒天然免疫中发挥作用，且其在乙肝相关HCC中的表达下调与不良预后相关。但RKIP在MASLD这一代谢性疾病中的功能，仍然是一个未知的领域。

发表在《Nature Communications》上的这项研究，首次揭示了RKIP在维持肝脏脂质代谢稳态中的关键保护作用。研究人员发现，饮食中的脂肪酸，特别是棕榈酸（PA），能够通过诱导内质网应激，抑制RKIP蛋白第133位半胱氨酸（Cys133）的S-棕榈酰化修饰，从而促进RKIP通过内质网关联降解（ERAD）途径被降解。更重要的是，他们阐明了RKIP的下游机制：RKIP能够与m⁶A阅读蛋白YTHDF1结合，并通过直接结合PEMT mRNA，促进YTHDF1识别PEMT mRNA上的m⁶A位点，从而高效地翻译生成磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶（PEMT）。PEMT是催化PE甲基化生成PC的关键酶，对于维持PC/PE比率和内质网稳态不可或缺。因此，HFD诱导的RKIP下调，会损害PEMT的蛋白翻译，打破PC/PE平衡，加剧内质网应激和脂质积聚，最终驱动MASLD的进展。这项研究不仅揭示了连接饮食脂肪与肝脏代谢紊乱的一条全新通路HFD–RKIP–PEMT轴，也为预防和治疗MASLD提供了有潜力的新靶点。

为开展此项研究，作者综合运用了多种关键技术方法。研究队列包括来自临床的MASLD患者及健康对照者的肝组织样本，并构建了多种饮食诱导（HFD、WD、MCD）的MASLD/MASH小鼠模型以及DEN诱导的HCC模型。细胞模型则涉及小鼠原代肝细胞、HepG2和HeLa细胞系。关键技术包括免疫印迹、免疫荧光、免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀（ChIP）、酰基-生物素交换（ABE）法检测蛋白质棕榈酰化、多核糖体图谱分析、L-叠氮高丙氨酸（AHA）标记新生蛋白质、脂质组学、RNA免疫共沉淀（RIP）、体外RNA-蛋白质Pull-down等。并利用肝细胞特异性、髓系细胞特异性、造血系统特异性RKIP基因敲除小鼠进行功能验证。

结果

Reduced RKIP is associated with poor MASLD progression

研究人员首先评估了MASLD进展中肝脏RKIP的表达情况。他们发现，与健康对照者相比，单纯性脂肪肝（lean）、MASL、MASH以及MASLD相关HCC患者的肝组织中，RKIP的mRNA和蛋白水平均显著降低。免疫荧光染色证实RKIP在MASLD患者肝细胞中的丰度明显下降。相关性分析显示，肝RKIP表达水平与血清ALT、AST和TG水平呈负相关。对公共数据库的RNA-seq数据进行分析，同样证实了MASLD患者肝组织中RKIP基因表达的下调。在动物模型中，高脂饮食（HFD）诱导的MASL小鼠和高脂高糖饮食（WD）诱导的MASH小鼠肝脏中，RKIP的表达也一致性降低。在体外，用饱和脂肪酸PA或不饱和脂肪酸OA处理小鼠原代肝细胞或HepG2细胞，均能下调RKIP的表达。进一步机制探讨发现，脂肪酸可能通过改变组蛋白修饰（如增加RKIP启动子区域的H3K9me3和H3K27me3水平）来转录抑制RKIP的表达。

Palmitic acids reduce the palmitoylation of RKIP^Cys133and promote the ERAD of RKIP

为了探究脂肪酸下调RKIP表达的机制，研究人员发现PA通过蛋白酶体途径降解RKIP蛋白，而内质网应激诱导剂（TM, Tha）同样能降低RKIP表达，内质网应激抑制剂TUDCA则可逆转PA诱导的RKIP减少。免疫荧光显示RKIP部分定位于内质网。进一步研究表明，PA通过促进RKIP与VCP的相互作用，诱导其经由ERAD途径降解。重要的是，脂肪酸修饰中的S-棕榈酰化对RKIP的稳定性至关重要。ABE实验表明，PA和ER应激能抑制RKIP的棕榈酰化。点突变实验证实，RKIP第133位半胱氨酸（Cys133）是其关键的棕榈酰化位点，C133A突变体棕榈酰化水平显著降低，蛋白稳定性下降，且与VCP的结合增强。筛选发现棕榈酰转移酶ZDHHC4和ZDHHC6与RKIP结合，而PA和ER应激能抑制ZDHHC4/6与RKIP的相互作用。这些结果强有力地表明，棕榈酸通过诱导内质网应激，抑制了ZDHHC4/6介导的RKIP^Cys133位点的棕榈酰化，从而促进了RKIP的ERAD。

Loss of RKIP in hepatocytes aggravates MASLD and MASLD-related HCC

利用基因敲除小鼠，研究人员探索了RKIP在MASLD中的功能。全身性RKIP敲除（KO）小鼠在HFD喂养后，肝脏脂滴积累、胶原沉积、肝脏重量/体重比、血清ALT/AST、肝脏TC/TG以及炎症和纤维化相关基因表达均比野生型（WT）小鼠显著加重。为了确定RKIP在哪种细胞中发挥作用，他们构建了髓系细胞特异性（Lysm^creRKIP^f/f）和造血系统特异性（VAV^creRKIP^f/f）敲除小鼠，发现这些敲除并不影响MASLD进程。然而，肝细胞特异性RKIP敲除（Alb^creRKIP^f/f）小鼠在HFD或WD喂养后，均表现出更严重的MASLD/MASH表型。在DEN诱导的MASLD相关HCC模型中，肝细胞RKIP缺失显著增加了肿瘤数量和大小。此外，衰老过程中肝细胞RKIP缺失也会促进肝脏脂质积聚。这些体内实验证实了肝细胞RKIP在抵抗MASLD及其相关HCC中的保护作用。体外实验同样表明，在原代肝细胞、HepG2和HeLa细胞中敲低或敲除RKIP会加剧脂滴积累，而过表达RKIP则能缓解此现象。

RKIP deficiency exacerbates ER stress and aggravates MASLD via impairing PEMT expression

机制上，RNA-seq分析提示RKIP缺失会下调与内质网功能相关的通路。进一步实验发现，在HFD喂养的小鼠肝脏和PA处理的细胞中，RKIP缺失显著增强了内质网应激关键指标（pIRE1, pPERK, peIF2α）的磷酸化水平。使用内质网应激抑制剂TUDCA处理，可以消除RKIP缺失导致的脂滴过度积累，并且在体内实验中，TUDCA治疗也逆转了肝细胞特异性RKIP敲除小鼠加重的MASLD表型。这表明RKIP通过缓解内质网应激来抑制MASLD。已知PC/PE比率失衡与内质网应激和MASLD密切相关。脂质组学分析显示，肝细胞特异性RKIP敲除小鼠肝脏中PC含量降低，PE含量升高，导致PC/PE比率下降，且PC和PE物种的变化呈现动态关联，提示PE向PC的转化过程存在缺陷。研究人员将目光投向了催化此转化的关键酶——PEMT。结果发现，RKIP缺失显著降低了PEMT的蛋白水平，但不影响其mRNA水平。在细胞实验中敲除或过表达RKIP，能相应地下调或上调PEMT蛋白。临床样本中也观察到RKIP与PEMT蛋白水平呈正相关。功能挽救实验表明，在RKIP缺失的细胞中过表达PEMT，可以逆转PC/PE比率失衡、内质网应激加剧和脂滴积累的表型；反之，敲低PEMT则能消除WT与RKIP KO细胞在这些表型上的差异。在体内，通过AAV病毒敲低肝脏PEMT，不仅加重了MASLD，也消除了RKIP^f/f与Alb^creRKIP^f/f小鼠在MASLD严重程度上的差异。此外，在肝细胞特异性RKIP和PEMT双敲除小鼠中，RKIP的缺失不再加重MCD饮食诱导的MASH。这些结果共同证明，RKIP缺失是通过下调PEMT蛋白水平，进而破坏PC/PE平衡和内质网稳态，从而加剧MASLD。

RKIP binds with PEMT mRNA and facilitates PEMT translation

最后，研究人员深入揭示了RKIP调控PEMT表达的分子机制。蛋白质合成抑制剂CHX实验和mRNA稳定性检测表明，RKIP不影响PEMT蛋白的降解或PEMT mRNA的稳定性。多核糖体图谱分析显示，RKIP缺失显著降低了PEMT mRNA在活跃翻译的多核糖体中的富集。利用AHA标记新生蛋白质的实验进一步证实，RKIP缺失特异性抑制了PEMT的新生蛋白质合成。这些结果说明RKIP在翻译水平促进PEMT表达。通过Co-IP-MS和后续验证，发现RKIP能与m⁶A阅读蛋白YTHDF1直接相互作用。生物信息学分析和CLIP-seq数据提示PEMT mRNA的3'UTR存在m⁶A修饰位点，且YTHDF1可结合PEMT mRNA。RIP实验证明，RKIP缺失会削弱YTHDF1与PEMT mRNA的结合，但不影响其m⁶A修饰水平。同时，RKIP本身作为一种RNA结合蛋白，也能直接与PEMT mRNA结合。体外Pull-down实验表明，RKIP可直接结合非甲基化的PEMT mRNA，且结合力强于YTHDF1。因此，RKIP可能通过直接结合PEMT mRNA，并招募YTHDF1至其m⁶A位点，从而协同促进PEMT的翻译。

结论与讨论

本研究系统地阐明了高脂饮食引发MASLD的一条新颖信号轴：HFD–RKIP–PEMT–ER稳态。研究发现，饮食中的脂肪酸（特别是棕榈酸）通过诱发内质网应激，抑制了位于内质网的棕榈酰转移酶ZDHHC4/6的活性，从而减少了RKIP蛋白在Cys133位点的棕榈酰化修饰，导致RKIP通过ERAD途径被降解。RKIP的下调削弱了其对PEMT mRNA翻译的促进作用。RKIP通过直接结合PEMT mRNA，并辅助m⁶A阅读蛋白YTHDF1识别PEMT mRNA，从而有效启动PEMT的蛋白质合成。PEMT是维持肝脏PC/PE比率的关键酶，其表达不足会导致PC/PE比率失衡，触发内质网应激，最终引起肝细胞脂质积聚和MASLD的发生发展。

该研究的创新性在于：首次将RKIP这一重要的信号调节因子与肝脏脂质代谢稳态紧密联系起来；揭示了蛋白质棕榈酰化修饰在代谢性疾病中的新颖调控模式（ER应激抑制棕榈酰化）；阐明了RKIP作为连接m⁶A阅读器和特定mRNA翻译的桥梁作用；明确了PEMT翻译调控是RKIP保护作用的核心下游事件。这些发现不仅深化了对MASLD发病机制的理解，更重要的是，将RKIP确立为一个有潜力的干预靶点。鉴于RKIP在MASLD患者肝脏中表达下调，且其表达水平与疾病严重程度负相关，未来或可通过靶向提升肝脏RKIP表达或活性的策略，为MASLD的防治开辟新的途径。此外，衰老作为MASLD的另一个重要风险因素，本研究发现衰老小鼠肝脏RKIP表达亦下降，提示RKIP-PEMT-ER轴可能在衰老相关MASLD中同样扮演角色，值得进一步探索。