TDP-43功能障碍通过破坏UPF1依赖性mRNA代谢在肌萎缩侧索硬化中导致RNA监测失衡

《Neuron》：TDP-43 dysfunction compromises UPF1-dependent mRNA metabolism in ALS

本研究针对肌萎缩侧索硬化（ALS）中TDP-43蛋白病理导致mRNA代谢紊乱的机制，通过整合磷酸化UPF1的RNA免疫共沉淀测序、基因敲低转录组分析和mRNA稳定性评估，首次在人多能干细胞衍生运动神经元中系统鉴定出UPF1介导的mRNA降解靶标，发现TDP-43功能缺失会损害UPF1磷酸化并引发选择性多聚腺苷化异常，导致具有长3‘ UTR的神经元转录本积累，揭示了ALS中RNA监测通路失调的新机制。

　　

在神经退行性疾病研究领域，肌萎缩侧索硬化（ALS）始终是科学家们攻坚的重点。这种疾病最令人困惑的谜团之一，是一种名为TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）的RNA结合蛋白的异常行为。在绝大多数ALS患者中，TDP-43会错误地从细胞核转移到细胞质中，并形成有害的聚集物。这种异常不仅剥夺了细胞核内正常的TDP-43功能，其细胞质聚集还可能产生新的毒性作用，共同导致运动神经元的逐渐死亡。

TDP-43作为细胞内的“RNA调度员”，负责调控基因信息的剪接、运输和稳定性维护。当它功能失常时，细胞内的RNA代谢就会陷入混乱。特别值得关注的是，许多由TDP-43功能障碍产生的异常mRNA含有提前终止密码子（PTC），理论上应该被细胞内的“质量监控系统”——无义介导的mRNA降解（NMD）通路识别并清除。然而，在ALS的病理环境下，这一重要的监控机制似乎并未有效运作，使得这些潜在有害的转录本得以积累。

由西北大学的Evangelos Kiskinis团队在《Neuron》上发表的研究，正是要解开这个谜团：在ALS中，TDP-43的病理变化如何影响UPF1介导的mRNA监测系统？他们通过多组学方法在人多能干细胞（iPSC）衍生的运动神经元模型中展开深入研究。

研究人员首先构建了运动神经元中UPF1调控网络的精确图谱。通过RNA免疫共沉淀测序（RIP-seq）技术，他们捕获了与活化形式UPF1（磷酸化UPF1，pUPF1）结合的mRNA，并结合UPF1敲低后的转录组变化和mRNA稳定性分析，鉴定出639个高可信度的UPF1靶标转录本。这些靶标最显著的特征是富含GC碱基、结构复杂且较长的3‘ 非翻译区（3’ UTR），而仅有约25%的靶标含有PTC，提示UPF1在运动神经元中的功能远超出传统的NMD范畴。

当研究人员模拟ALS病理条件，降低运动神经元中的TDP-43水平时，发现了令人惊讶的现象：UPF1的磷酸化水平显著降低，表明其活性受到抑制。进一步实验揭示，TDP-43与UPF1之间存在RNA依赖性的相互作用，两者在ALS患者的病理包涵体中共同聚集。这种异常互动直接损害了UPF1依赖性的mRNA监控功能。

研究还发现，TDP-43和UPF1共同调控大量基因的选择性多聚腺苷化（APA），影响其3‘ UTR长度。在TDP-43功能缺失的情况下，包括突触蛋白2（SYN2）和G3BP1在内的多个重要神经元基因倾向于使用远端多聚腺苷化位点，产生具有更长3’ UTR的转录本。这些长3‘ UTR异构体由于稳定性较差，导致相应蛋白质水平下降，可能影响突触功能和解压应激反应。

对ALS患者死后脑组织和脊髓组织的分析证实了这些发现，患者神经元中确实存在广泛的APA异常，且与UPF1靶标基因的上调相关，印证了在疾病背景下UPF1介导的RNA监测功能受损。

关键技术方法包括：利用iPSC衍生的人类运动神经元模型模拟疾病状态；通过RNA免疫共沉淀测序（RIP-seq）鉴定UPF1直接靶标；结合转录组测序（RNA-seq）和mRNA稳定性分析评估转录后调控；采用基因集富集分析（GSEA）评估通路水平变化；通过免疫共沉淀和免疫荧光验证蛋白质相互作用和细胞定位；使用选择性多聚腺苷化分析（DaPars）评估3‘ UTR长度变化；对ALS患者死后组织（包括纽约基因组中心队列）进行转录组分析验证临床相关性。

识别人类运动神经元中真正的UPF1靶标转录本

研究人员通过整合pUPF1 RIP-seq、UPF1敲低后的差异表达分析和mRNA稳定性评估，在iPSC衍生的运动神经元中鉴定出639个高可信度的UPF1靶标基因。这些靶标转录本具有GC含量高、长度较长且结构复杂的3‘ UTR特征，主要参与自噬等细胞过程。

运动神经元中UPF1靶标转录本具有长且高度结构化的3‘ UTR

对UPF1靶标的结构特征分析显示，这些mRNA普遍具有长而结构化的3‘ UTR，富含UPF1结合基序。仅有少数靶标含有PTC或上游开放阅读框（uORF），表明在运动神经元中，UPF1主要通过3’ UTR结构特征而非经典NMD机制来识别靶标。

TDP-43功能缺失导致UPF1磷酸化和mRNA降解效率降低

TDP-43敲低显著降低了UPF1的磷酸化水平，而不影响总UPF1蛋白量。基因集富集分析显示，UPF1靶标基因在TDP-43缺陷的运动神经元中普遍上调，表明UPF1介导的mRNA监控功能受损。

TDP-43与UPF1在运动神经元中通过RNA相互作用并在ALS患者组织中共同聚集

免疫共沉淀实验证实TDP-43与UPF1/pUPF1之间存在RNA依赖性的相互作用。在散发性和C9orf72突变ALS患者的脊髓运动神经元中，UPF1与病理性的TDP-43包涵体共定位，而在健康对照中则呈弥散性细胞质分布。

UPF1和UPF2协同降解TDP-43依赖性隐性转录本

虽然TDP-43缺失导致大量错误剪接的PTC-containing转录本积累，但仅同时敲低UPF1和UPF2（而非单独敲低任一因子）能显著增强这些异常转录本的积累，表明UPF1和UPF2在降解TDP-43依赖性隐性转录本中具有协同作用。

TDP-43功能缺失改变ALS相关基因的多聚腺苷化和蛋白水平

TDP-43敲低引起2，033个APA事件，其中73%导致3‘ UTR延长。这些3’ UTR延长的转录本富集于突触小泡运输等相关功能，且其表达水平普遍下调。SYN2的长3‘ UTR异构体表现出较低的RNA稳定性和蛋白表达水平，解释了TDP-43缺失导致的SYN2蛋白下调。

UPF1和TDP-43共同调控选择性多聚腺苷化和3‘ UTR长度

UPF1和TDP-43敲低均引起广泛的APA变化，且两者高度重叠。在ALS患者脊髓和皮层神经元中验证了类似的APA变化，表明TDP-43-UPF1轴调控的3‘ UTR长度改变是ALS病理的重要特征。

本研究系统阐明了ALS中TDP-43病理与UPF1依赖性mRNA监测之间的内在联系。研究发现不仅揭示了TDP-43功能障碍通过损害UPF1磷酸化而破坏mRNA监控的新机制，还发现了TDP-43与UPF1在调控选择性多聚腺苷化和3‘ UTR长度方面的协同作用。这些发现为理解ALS的分子病理提供了新视角，指出恢复UPF1功能可能成为缓解TDP-43蛋白毒性作用的潜在策略。研究建立的运动神经元特异性UPF1靶标图谱也为评估ALS中NMD活性提供了有价值的生物标志物。