ZAP327信号域驱动的嵌合抗原受体在小鼠模型中能产生强效且持久的抗肿瘤免疫反应

《Science Translational Medicine》：ZAP327 signaling domain–driven chimeric antigen receptor generates robust and long-term antitumor immunity in mouse models

研究显示，将ZAP70的327-619氨基酸序列（ZAP327）作为CD3ζ信号域的替代，可显著降低CAR T细胞治疗中的炎症因子释放，同时增强抗肿瘤活性与T细胞持久性。机制表明，ZAP327通过抑制T细胞耗竭标志物（如PD1、TIM3）并促进干细胞样记忆T细胞（TSCM）增殖，结合代谢重编程（从糖酵解转向氧化磷酸化）实现更持久的免疫应答，尤其在低抗原表达肿瘤模型中效果显著。

　　
CAR T细胞疗法作为血液肿瘤治疗的重要手段，在近年来取得显著进展的同时，仍面临两大核心挑战：一是部分患者治疗后易出现复发，二是治疗过程中可能引发严重的细胞因子风暴等毒性反应。针对这些问题，科研团队通过创新性的信号域改造策略，开发出具有更强疗效和更低毒性的新型CAR T细胞疗法，相关研究成果在《Science Translational Medicine》发表。该研究通过系统性的分子改造和深入的功能验证，揭示了ZAP70激酶结构域（具体为ZAP327亚型）在优化CAR T细胞功能中的关键作用。

研究团队首先针对CAR结构中的核心组件——CD3ζ信号域进行了创新性替换。传统CAR通过CD3ζ信号域将抗原识别信号传递至细胞内，但这一结构常导致过度激活和炎症反应。研究显示，将ZAP70的特定激酶结构域（从第327个氨基酸开始截取的ZAP327亚型）替代CD3ζ后，新型CAR T细胞展现出独特的优势：在体外实验中，ZAP327改造的CAR T细胞分泌的IFN-γ、IL-2和TNF-α等促炎细胞因子较传统CD3ζ CAR减少30%-50%，但肿瘤杀伤活性保持或增强。这种"减毒增效"的特性在多个体外模型中得到验证，包括不同刺激强度下的增殖能力测试、代谢途径分析以及分子机制研究。

在体内抗肿瘤实验中，研究团队构建了三个关键模型进行验证：首先在Raji细胞诱导的急性淋巴细胞白血病模型中，ZAP327 CAR T细胞治疗组的平均存活时间较传统组延长50天以上，且75天存活率从传统疗法的9%提升至45%。其次在实体瘤模型（如MM231-CD19乳腺癌移植瘤）中，ZAP327改造的CAR T细胞显著抑制肿瘤生长，且通过荧光标记观察到其体内存活时间较传统组延长3倍。第三，在抗原低表达模型（CD19低表达的白血病细胞系）中，ZAP327 CAR展现出与传统组相当的肿瘤杀伤活性，但细胞因子风暴风险降低70%。这些结果在多个独立实验中重复验证，包括不同供体来源的T细胞转导效率测试和不同肿瘤模型的交叉验证。

研究进一步揭示了ZAP327信号域发挥作用的分子机制。通过比较传统CD3ζ和ZAP327改造后的CAR T细胞：1）在代谢层面，ZAP327组从糖酵解转向氧化磷酸化途径的效率提升40%，这与其增强的细胞持久性直接相关；2）在免疫记忆方面，流式细胞术显示ZAP327组CD45RO?CD62L?的干细胞样记忆T细胞比例增加2.3倍，同时PD1、TIM3等耗竭标志物表达量降低60%-80%；3）信号通路分析表明，ZAP327通过调控LAT磷酸化水平（降低35%）减少NFAT激活，从而抑制促炎因子分泌，同时保持足够的穿孔素和颗粒酶B分泌以维持杀伤活性。

研究还创新性地构建了不同共刺激信号组合的ZAP327 CAR变体：CD28/ZAP327组合在代谢重编程效率上较4-1BB/ZAP327组合提升25%，但后者在实体瘤穿透和长期存留方面表现更优。这种差异可能与共刺激信号对ZAP327构象的影响有关，研究团队通过冷冻电镜技术首次解析了ZAP327在CD28结构中的空间构象，发现其 kinase结构域与CD28的免疫球蛋白样结构形成稳定的复合体，这种空间耦合既保证了激酶活性又避免了过度激活。

临床转化潜力方面，研究特别设计了与现有疗法兼容的递送方案。通过将ZAP327域与临床已验证的CD28/4-1BB共刺激结构域进行模块化组合，既保留了传统CAR T的制造工艺优势，又实现了信号调控的精准优化。动物实验显示，在实体瘤模型中，ZAP327 CAR T细胞通过肿瘤微环境中的血管新生促进因子（如VEGF）的持续分泌，激活了旁观者效应，使疗效提升至传统疗法的3倍。

值得关注的是，该研究首次提出了"代谢-免疫记忆协同"假说。通过Seahorse细胞分析平台发现，ZAP327 CAR T细胞在氧气利用效率（OCR）和线粒体膜电位（ΔΨ）等关键指标上优于传统组，这种代谢优势使细胞在持续刺激环境下仍能维持20%以上的活性增殖率。转录组测序进一步揭示，ZAP327组上调了与干细胞维持相关的BCL6、IL7R等基因表达，同时下调了促进耗竭的TOX和NR4A1基因。

在安全性评估方面，研究团队创新性地建立了"双阶段毒性监测系统"：第一阶段通过体外细胞因子释放实验评估即时毒性，第二阶段通过体内代谢组学（检测乳酸、丙酮酸等代谢物）和影像学（荧光标记追踪细胞存留）综合评估长期安全性。结果显示，ZAP327 CAR T细胞在治疗4周后仍保持85%以上的存活率，且未出现与传统疗法相关的神经毒性或毛细血管渗漏综合征（CSS）。

研究还深入探讨了ZAP70信号域的作用边界。通过系列 truncation实验发现：1）保留ZAP70激酶结构域（ZAP255）即可维持基本功能，但ZAP327（去除部分N端结构域）在功能完整性和毒性控制间取得更好平衡；2）ZAP327需与至少12个氨基酸的间隔区（来自CD28的 hinge region）结合才能保持最佳活性，这解释了为何直接融合TM与ZAP255会导致功能丧失；3）LCK激酶在传统CD3ζ信号传导中起关键作用，但ZAP327信号域通过激活Fyn激酶形成替代信号通路，这种替代机制在敲除LCK基因的细胞模型中仍能维持70%以上的杀伤活性。

针对临床转化，研究团队已建立标准化生产流程：采用慢病毒转导结合磁珠分选技术，确保ZAP327 CAR的转导效率稳定在95%以上。在预临床模型中，ZAP327 CAR T细胞展现出优于PD-1抑制剂的持久抗肿瘤效应，且未出现抗体依赖增强细胞毒性（ADE-C__).此外，研究首次发现ZAP327 CAR在CD19低表达（<1000 copies/细胞）的肿瘤模型中仍能保持80%以上的杀伤效率，这为处理抗原异质性提供了新思路。

未来研究方向方面，团队计划开展：1）多组学整合分析，探索ZAP327如何调控非编码RNA和表观遗传修饰；2）开发ZAP327-CAR与CAR-NK细胞联用系统，利用自然杀伤细胞的代谢特性弥补部分T细胞缺陷；3）构建生物可降解载体系统，实现ZAP327 CAR的缓释递送。这些研究将有助于建立新一代CAR T疗法的标准化评价体系，推动从实验室向临床应用的转化进程。

该研究的重要启示在于：CAR T细胞的疗效不仅取决于抗原识别的灵敏度，更依赖于信号通路的精准调控。ZAP327通过"信号降调-代谢重编程-记忆扩增"的三重机制，实现了疗效与安全性的同步优化。这种"以简驭繁"的设计理念，为未来开发其他新型免疫疗法（如CAR-NK、CAR-MSC等）提供了理论框架和技术范式。随着ZAP327 CAR的临床前研究不断深入，有望在3-5年内推动相关疗法进入临床试验阶段，为实体瘤和复发难治性血液肿瘤开辟新治疗路径。