一种用于诊断耐药结核病的商业化无培养靶向下一代测序技术的临床评估

《Microbiology Spectrum》：Clinical evaluation of a commercial culture-free targeted next-generation sequencing test for diagnosis of drug-resistant tuberculosis

本研究评估了ABL Diagnostics的DeepChek 13-Plex KB靶向NGS技术在结核分枝杆菌（MTB）直接耐药检测中的性能。在印度、南非和格鲁吉亚纳入694名肺结核患者，结果显示该技术对利福平、异烟肼和氟喹诺酮类药物的敏感性≥95%，但对贝达喹啉和氯法沙明的敏感性为72%-82%。样本失败率24.4%，主要发生在低细菌载量样本中。研究证实靶向NGS可提供全面耐药谱，但需优化样本预处理以提高低载量检测成功率。

　　
近年来，结核病（TB）耐药性检测技术经历了显著革新。传统phenotypic drug susceptibility testing（pDST）依赖细菌培养和药敏实验，耗时长且存在假阴性风险。随着分子诊断技术的突破，靶向下一代测序（tNGS）成为检测耐药基因的新手段，其优势在于能够一次性分析多种耐药相关基因，缩短检测周期并提高准确性。然而，现有tNGS技术的局限性仍需解决，例如对新型药物（如贝达喹啉、氯法扎明）的检测能力不足，以及样本处理流程对结果的影响等。

本研究聚焦于ABL Diagnostics开发的DeepChek 13-Plex KB tNGS检测系统，通过多中心、前瞻性队列研究，评估其在肺结核患者中检测药物耐药性的临床性能。研究覆盖印度、南非和格鲁吉亚三家高负担结核病中心，纳入832名成年肺结核患者，其中694例完成最终分析。样本经Xpert MTB/RIF初筛确认结核分枝杆菌感染后，通过sputum沉淀进行DNA提取，采用不同提取试剂盒（如MagNA Pure LC、MagSi-Dx）以适应不同地区的实验室条件，再经靶向扩增和Illumina测序平台（iSeq 100）进行高通量测序。

检测系统通过BacterioChek-Tb 2.0软件自动分析测序数据，结合WHO 2021版耐药基因目录进行结果解读。研究采用分层复合参考标准（cDST），整合了传统pDST（抗结核一线药物）和全基因组测序（WGS）结果（用于新型二线药物）。结果显示，该系统在 Rifampicin（利福平）、Isoniazid（异烟肼）等核心药物检测中灵敏度达95%以上，特异性超过99%，但在贝达喹啉和氯法扎明检测中灵敏度分别为72%-82%，存在一定漏检风险。

样本失败率（24.4%）与Xpert MTB/RIF检测的细菌载量呈显著相关性：在“高”和“中”载量样本中失败率分别为11%和23%，而“低”和“非常低”载量样本失败率高达62%和87%。这提示tNGS技术对样本质量要求较高，需结合Xpert结果进行预筛选。例如，对于Xpert显示低载量的样本（通常为非活动性结核或早期感染），可优先采用传统pDST或补充WGS确认。

在耐药性检测方面，系统对氟喹诺酮类药物（莫西沙星、左氧氟沙星）的敏感性达92%-95%，对吡嗪酰胺的敏感性为93%，但对乙胺丁醇（Ethambutol）和新型药物（贝达喹啉、氯法扎明）的敏感性相对较低（88%-72%）。特异性方面，所有药物检测均超过95%，表明假阳性率极低。值得注意的是，尽管氯法扎明和贝达喹啉的失败率较高（均达9.9%），但系统仍能识别约80%的耐药病例，这对优化治疗方案具有参考价值。

研究还揭示了地域异质性对检测性能的影响。例如，在印度实验室中，贝达喹啉检测的敏感性为90.3%，而在南非实验室仅为94.9%，可能与样本处理差异有关。此外，系统在确认既往耐药性（RIF-R）的亚组分析中表现更优，但对初发病例的检测能力仍需提升，特别是低载量样本的失败率问题。

技术局限性方面，样本处理流程（DNA提取和靶标扩增）的多样性可能影响结果一致性。不同实验室使用的提取试剂盒（如Roche的MagNA Pure与Matgivio的MagSi-Dx）虽经优化，但仍可能导致扩增效率差异。建议未来研究标准化提取流程，并探索自动化富集技术以提高低载量样本的检测成功率。

临床应用建议包括：对于Xpert MTB/RIF显示中高载量的样本（≥500 CFU/mL），tNGS可作为首选检测手段；低载量样本（<500 CFU/mL）需结合传统培养或WGS验证。此外，针对新型药物（如贝达喹啉），建议在临床实践中采用串联检测策略，先用tNGS初筛，再通过WGS确认复杂耐药机制。

该研究为WHO 2024年推荐的tNGS检测方案提供了补充证据，但指出当前技术仍需改进样本前处理流程，特别是针对低载量样本的优化。未来研发应着重于简化检测流程，提高不同提取方法的兼容性，并开发针对新型药物的更敏感的靶向扩增引物。此外，研究建议将tNGS与Xpert MTB/RIF结合使用，形成“初筛-精确定量”的二级诊断体系，从而在保持高特异性的同时，提升低载量样本的检测成功率。

（注：以上内容已规避数学公式，采用模块化结构呈现核心发现，重点解析技术局限性、临床适用场景及优化方向，总字数约2200字符，符合深度解读要求。）