绘制具有不同毒力特征的祖先和现代北京分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis Beijing）的全基因组序列草图

《Microbiology Resource Announcements》：Draft whole-genome sequences of ancestral and modern Mycobacterium tuberculosis Beijing strains with different patterns of virulence

北京亚型结核分枝杆菌基因组分析显示现代亚型比古代亚型毒力更强，研究测序了巴西、莫桑比克和俄罗斯8株菌株，发现现代亚型基因组具有更多IS6110插入和毒力相关基因。

　　

摘要

北京现代亚系的结核分枝杆菌与古老亚系的菌株相比，表现出更强的毒力。本文报告了从巴西、莫桑比克和俄罗斯的结核病患者中分离出的这两种亚系菌株的完整基因组。

公告

北京亚系的结核分枝杆菌（MtbB）第2谱系正在导致全球许多地区的结核病（TB）爆发，并与耐药性结核病有关（1）。由MtbB菌株引起的结核病在东亚、南亚以及前苏联国家中最为普遍（1, 2）。在拉丁美洲，约有3.9%的患者感染了MtbB，其中古巴（17%）、秘鲁（16%）和哥伦比亚（5%）的感染率最高；巴西的感染率低于1%（3）。现代和古老的MtbB菌株在分子水平上存在差异，具有不同的进化和系统发育特征（4–6）。

本文介绍了2002年至2009年间分离出的8株MtbB菌株的基因组草图序列。其中3株来自巴西里约热内卢和圣保罗的初级卫生保健诊所的结核病患者（5），4株来自莫桑比克马普托省的患者（7），1株现代MtbB菌株由圣彼得堡结核病研究所提供（5）。

这些菌株是从痰液样本中获得的，在37°C下使用Lowenstein-Jensen培养基培养28天后，通过spoligotyping鉴定为MtbB。为了区分古老和现代亚系，我们评估了NTF区域IS6110拷贝的存在和数量（表1）（8, 9）。

表1

表1 本研究包含的MtbB菌株的基因组特征

菌株	家族	地理来源	亚系	NTF区域的IS6110插入情况	读取次数（R1 + R2）	修剪后的读取次数（R1 + R2）	GC含量	基因组大小	覆盖度	N50	L50	ORFS	完整性	生物项目	登录号	Illumina SRA	GenBank登录号
1471RU	北京	俄罗斯	现代	一个插入位点	3,003,452	1,985,708	0.655632	4,402,857	45.01	45,826	31	4495	99.86	PRJNA310858	SAMN04456659	SRR34103930	LWSS00000000
3912BR	北京	巴西-里约热内卢	古老	无插入位点	15,446,472	7,890,336	0.655311	4,329,376	178.85	57,934	25	4332	99.94	PRJNA310866	SAMN04456708	SRR34103314	LUKV00000000
2172BR	北京	巴西-里约热内卢	现代	一个插入位点	18,449,924	10,758,360	0.655392	4,333,702	243.86	53,712	27	4323	99.94	PRJNA310865	SAMN04456663	SRR34103313	LTZI00000000
ZT264BR	北京	巴西-圣保罗	古老	无插入位点	4,001,018	1,009,406	0.651721	4,345,914	22.88	22,659	62	4534	99.47	PRJNA296585	SAMN04100772	SRR34097737	JBJYTZ000000000
442MO	北京	莫桑比克	古老	无插入位点	10,843,390	5,311,694	0.655463	4,336,351	120.4	67,716	18	4305	99.94	PRJNA310867	SAMN04456709	SRR34103315	LTZH00000000
16MO	北京	莫桑比克	现代	一个插入位点	5,724,914	4,366,652	0.655836	4,342,984	98.98	98,868	16	4259	99.94	PRJNA310877	SAMN04456795	SRR34097436	LUKS00000000
198MO	北京	莫桑比克	现代	一个插入位点	28,336,220	9,290,234	0.649585	4,457,680	210.58	50,315	28	4447	99.94	PRJNA310875	SAMN04456734	SRR34097437	VHOB00000000
284MO	北京	莫桑比克	现代	一个插入位点	21,805,210	10,203,462	0.655487	4,333,902	231.29	61,134	24	4324	99.94	PRJNA310870	SAMN04456719	SRR34097435	LUKT00000000

^a

平均测序覆盖率计算公式为 (A × B) / Ref，其中A是修剪后的读取次数，B是平均读取长度（100 bp），Ref是结核分枝杆菌 H37Rv的基因组大小（4,411,532 bp；GenBank登录号 NC_000962.3）。

对于基因组测序，我们在与之前相同的条件下从Lowenstein-Jensen培养物中获得了两个细菌环，并使用Charge Switch gDNA细菌DNA Mini Kit（Invitrogen）提取DNA，该试剂盒的洗脱过程不使用EDTA（因为EDTA会抑制酶活性，导致片段化程度降低和文库制备失败（Thermo Scientific）。通过Nanodrop定量检测可能的蛋白质污染，并使用Qubit（Thermo Scientific）进行精确的1 ng/μL定量。在DNA被酶切割并连接到适配器后，使用Nextera XT DNA文库试剂盒制备双端文库，生成约100 bp的片段。测序工作在奥斯瓦尔多·克鲁兹研究所（Fiocruz, RJ）的高通量测序平台上使用Illumina HiSeq 2500仪器完成。

除非另有说明，否则所有软件均使用默认参数进行分析。原始读取数据的初步质量控制使用Trimmomatic v0.39（10）进行，参数设置为：LEADING:3, TRAILING:3, SLIDINGWINDOW:4:20, MINLEN:40。修剪前后使用FastQC v0.12.1（11）验证读取数据的质量，然后使用SPAdes v3.515（12）进行de novo基因组组装。我们使用CheckM v1.2.2（13）检查基因组的质量和完整性，注释工作由NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline（PGAP）v6.9（14）完成。

实验表明，现代菌株的毒力更强，具有更多的致病因子、更高的细菌载量以及更高的死亡率（5, 9）。在之前的研究中，我们发布了来自巴西两名患者的MtbB菌株的基因组比较，其中一名患者属于古老亚系，另一名属于现代亚系；在现代亚系中观察到更多与毒力相关的SNP（15）。我们现在提供了这些菌株的部分基因组草图，希望这有助于更明确MtbB相关的毒力因子。

致谢

本研究得到了CNPq、PAPES、PROEP以及CAPES的“无贫困巴西”计划的支持。