Lmod3消融会破坏听觉功能，但不会影响毛细胞的立体纤毛发育或代谢能力（MET competence）

《Biochimie》：Lmod3 ablation disrupts auditory function without compromising hair cell stereocilia development or MET competence

F-actin细胞骨架在耳蜗外毛细胞中起关键作用，该研究鉴定出LMOD3作为特异性表达的F-actin聚合因子，其基因敲除导致约40分贝的听神经脑干反应阈值升高和畸变产物耳声发射阈值异常，但未影响毛细胞形态和听力学功能。

　　

杜海波|黄曦|孙一晓|周浩

隶属于中国人民解放军空军军医大学航空特色医疗中心，中国北京100142

摘要

F-actin细胞骨架在毛细胞中起着关键作用。本研究确定了LMOD3这种F-actin聚合蛋白，它特异性地表达在小鼠的外毛细胞（OHCs）中。Lmod3基因敲除会导致显著的听力损失（听觉脑干反应（ABR）阈值升高约40分贝，耳声发射（DPOAE）阈值增加），但耳毛的形态和机械电转导（MET）功能保持完好。表型分析表明，LMOD3的缺乏可能会损害基于OHC的耳蜗放大功能。我们的工作证实了LMOD3对听觉功能的重要性。

引言

F-actin作为细胞骨架的重要组成部分，提供机械支持，维持细胞形态，并参与多种生理过程，包括信号转导和肌肉收缩¹。在听觉毛细胞中，F-actin参与耳毛、角质板、侧壁和带状突触等结构的发育和功能维持^{2, 3, 4, 5}。超过20种与actin结合的蛋白质或编码actin的基因突变与感音神经性听力损失有关^{6, 7, 8, 9}，其中大多数导致耳毛的结构/功能缺陷，而其他突变则影响角质板或突触组织。

对鸡胚胎和豚鼠的研究表明，毛细胞中γ-actin与β-actin的比例为2:1^{10, 11, 12}。γ-actin是角质板和侧壁中的主要亚型，而两种亚型在耳毛中共同形成平行的、无分支的actin束^{10, 11}。错义突变ACTG1（p.T89I）和ACTB（p.R183W）与人类的进行性听力损失有关^{13, 14}。动物模型进一步表明，全身性的γ-actin敲除或耳毛特异性β-actin缺失会导致延迟出现的听力障碍，并伴有耳毛异常¹⁵。此外，几种与actin结合和调节相关的蛋白质，如Myo15a、Espin、Whirlin、LGN和Twinfilin^{16, 17, 18, 19}，也被证明参与耳毛的发育和形态维持。然而，到目前为止，这些亚细胞结构中启动F-actin聚合的关键蛋白质分子尚未被确定。

外毛细胞的圆柱形细胞体具有独特的三层侧壁结构，包括：（1）质膜，（2）含有平面F-actin/spectrin阵列的细胞骨架层，以及（3）位于下方的囊泡（SSC）^{20, 21, 22, 23}。在细胞骨架层中，F-actin-spectrin网络构成了结构骨架，其中散布着一些尚未鉴定的柱状连接器，这些连接器可能介导膜与细胞骨架的连接^{23, 24}。这种特殊的组织结构使得侧壁能够维持细胞刚性并促进电运动^{24, 25}。具体来说，F-actin-spectrin晶格限制了Prestin在膜平面内的移动性，从而优化了其电压依赖性的构象变化^{26, 27, 28}。在沙鼠中，F-actin从出生（P0）就开始存在于侧壁中，在P3后逐渐减少，并在P12时稳定下来，此时听觉功能开始发育²⁹。Prestin和spectrin的表达在P12后也表现出类似的稳定趋势。相应地，OHC的硬度从P3开始逐渐降低，在P9后再次增加，并在P12时稳定²⁹。Diamide和latrunculin都会损害机械性能和Prestin介导的电运动，这突显了F-actin网络在听觉转导中的关键作用³⁰。然而，控制侧壁F-actin组装及其对细胞体运动的贡献的机制仍不清楚。

Leiomodins（LMOD1-3）是一类独特的蛋白质，它们调节F-actin的聚合，与Arp2/3复合体和Formin蛋白不同。LMOD1主要存在于平滑肌细胞中，而LMOD2和LMOD3主要表达在心肌和骨骼肌细胞中^{31, 32, 33}。Lmod3基因的突变会导致严重的肌病，表现为肌肉发育显著受损、呼吸困难和肢体无力^{34, 35, 36, 37, 38}。从结构上看，Leiomodins具有N端的tropomyosin结合位点（TMBS）和三个actin结合位点（ABS1、ABS2和ABS3）³⁹。转录组测序显示其在毛细胞中有特异性表达⁴⁰（https://shield.hms.harvard.edu/），在研究毛细胞转分化时常被用作外毛细胞的特征性标记^{41, 42}。然而，LMOD3在毛细胞中的确切作用仍不清楚。在这里，我们使用敲除小鼠模型来研究LMOD3在毛细胞中的生物学作用。

章节片段

小鼠

本研究中使用的LMOD3敲除小鼠来自复旦大学⁴³。这些小鼠是通过PB（PiggyBac）转座子系统构建的，该系统将一段外源基因插入Lmod3基因组的第2和第3外显子之间，从而影响Lmod3的表达。该小鼠品系最初是在C57BL/6J遗传背景下产生的（Jackson Laboratories，美国）。小鼠的基因分型引物如下：

Lmod3-test-F: 5’-GAGGTGTTGGTCCACAGTCA-3’

Lmod3

LMOD3主要表达在外毛细胞的细胞体中

为了研究LMOD3蛋白在小鼠毛细胞中的精确定位，我们对P14小鼠的基底膜进行了整体免疫染色，随后进行了高分辨率共聚焦显微镜观察。三维重建后的免疫荧光结果显示，LMOD3主要表达在外毛细胞中，在内毛细胞中未检测到其表达，并且在整个细胞体中呈弥漫性分布（图1A）。3个月大的野生型小鼠的毛细胞染色结果同样如此

讨论

LMOD3主要表达在骨骼肌中，在那里它对细丝的结构和功能起着关键作用^{43, 44}。人类LMOD3的突变通常会导致严重的临床症状，受影响个体的存活率很低，只有少数能存活到青春期^{34, 37}。存活率的差异主要由突变的类型和位置决定^{34, 37, 38}。转录组测序显示Lmod3在毛细胞中有特异性表达

CRediT作者贡献声明

黄曦：正式分析、研究、验证。杜海波：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 初稿、验证、监督、研究、正式分析、概念化。周浩：撰写 – 审稿与编辑、研究、正式分析。孙一晓：撰写 – 审稿与编辑、验证、研究、正式分析

利益冲突

无。

利益声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务或个人关系可能会影响本文所述的工作。所有作者均无需要披露的利益冲突。

竞争利益声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了山东省自然科学基金（ZR2020QC098，资助人H.D.）的支持。资助方未参与研究设计、数据收集与分析、发表决定或手稿的准备。