《Carbohydrate Polymers》：Polysaccharides from
Syzygium aromaticum binding to 3CLpro contain glycoproteins interacting with RdRp against SARS-CoV-2
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多组分抗新冠病毒活性研究及机制探索。通过分离丁香多糖及糖蛋白，发现粗多糖922和其糖蛋白组分9222P、9224P能显著抑制SARS-CoV-2复制，抑制率达98.86%。结构分析表明，922211仅与3CLpro结合但无抗病毒活性，而9222P、9224P同时结合3CLpro和RdRp，可能通过抑制RNA延伸发挥作用。体内实验证实922具有高效肺部递送和持久保留特性。研究揭示了酸性多糖与病毒复制关键酶的相互作用机制及递送潜力。
参与作者包括：金灿（Can Jin）、冯波（Bo Feng）、窦鹏飞（Pengfei Dou）、周圆（Yuan Zhou）、郭婷婷（Tingting Guo）、刘玉轩（Yuxuan Liu）、丁雅琪（Yaqi Ding）、李美霞（Meixia Li）、陈霞（Xia Chen）、杜振云（Zhenyun Du）、黄春帆（Chunfan Huang）、李轩（Xuan Li）、徐小娟（Xiaojuan Xu）、徐赫里克（H. Eric Xu）、陈新文（Xinwen Chen）、王凯平（Kaiping Wang）、臧毅（Yi Zang）、贾莉（Jia Li）和丁侃（Kan Ding）。
中国科学院上海药物研究所中山药物发现中心，中国广东省中山市中山翠亨新区SSIP医疗与医药示范区，邮编528400。
摘要
开发抗SARS-CoV-2药物对于战略药物储备仍然非常重要。3-糜蛋白酶样蛋白酶（3CLpro）和RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）是新COVID-19药物的关键靶点。此前我们发现多糖可以结合3CLpro从而抑制SARS-CoV-2的复制。我们进一步假设天然多糖可能通过同时结合3CLpro和RdRp来阻断病毒复制。在本研究中，我们发现来自Syzygium aromaticum的粗多糖922几乎完全阻断了病毒复制，而其糖蛋白组分9222P和9224P也表现出较强的抗病毒效果。尽管来自922的果胶多糖922,211与3CLpro有相互作用，但它没有显示出抗病毒效果。机制研究表明，922,211、9221S与3CLpro结合；然而只有9222P和9224P与RdRp结合。进一步分析表明，9222P和9224P可能抑制RNA的延伸。总体而言，922的抗病毒活性主要来源于其9222P和9224P对RdRp的靶向作用，同时也部分依赖于与3CLpro相互作用的成分。额外研究表明，922、9222P和9224P能够被Vero E6细胞内化。荧光标记和放射性标记的922通过鼻腔给药后，在体内能够有效输送并持续保留。这些发现表明922具有作为抗病毒候选物质的潜力。
引言
2019冠状病毒病（COVID-19）由新型严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起，由于新变种的出现以及一些现有治疗手段的效果有限或难以获取，该疾病在2025年仍对全球健康构成挑战（Majumder & Minko, 2021）。SARS-CoV-2是一种包膜型、正链单链RNA病毒，大小约为30 kDa，编码四种结构蛋白（刺突蛋白[S]、包膜蛋白[E]、膜蛋白[M]和核衣壳蛋白[N]），以及关键的非结构蛋白，如RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）、主要蛋白酶（3CLpro）和木瓜蛋白酶样蛋白酶（PLpro）（Asselah et al., 2021; Yadav et al., 2021）。这些蛋白对病毒复制和宿主细胞侵入至关重要，因此是开发抗病毒药物的有吸引力的靶点（Báez-Santos et al., 2015; Moustaqil et al., 2021）。已知刺突蛋白的S1亚基与人ACE2受体结合以启动病毒入侵，而3CLpro和PLpro在复制过程中介导病毒多聚蛋白的蛋白水解（Yeung et al., 2021）。因此，开发能够抑制S-ACE2相互作用或抑制3CLpro、PLpro或RdRp酶活性的抗病毒疗法是应对SARS-CoV-2的有希望策略（Yan & Gao, 2021）。天然大分子，特别是多糖，因其多靶点、低毒性和免疫调节特性而受到越来越多的关注（Kocabiyik et al., 2021）。几种硫酸化多糖，如肝素、卡拉胶和岩藻多糖，通过阻断病毒进入或复制表现出强烈的抗病毒效果（Modak et al., 2021; Tandon et al., 2021）。其作用机制通常涉及多糖上的负电荷硫酸基团或羧基与病毒蛋白（如刺突糖蛋白）上的正电荷残基之间的静电相互作用（Hu et al., 2021）。基于这些发现，我们假设富含羧基的酸性植物多糖——尽管缺乏硫酸化——也可能通过靶向SARS-CoV-2感染的关键蛋白而发挥抗病毒作用。为了验证这一假设，我们选择了Syzygium aromaticum（丁香），这是一种广泛用于抗炎和抗菌的传统中药。虽然丁香中的挥发性精油（如丁香酚）已被证明具有抗病毒活性（Batiha et al., 2020; Radünz et al., 2019），但其水溶性大分子成分（如多糖或糖蛋白）的抗病毒潜力尚未被探索。考虑到丁香通常以煎剂形式使用，临床应用中的活性抗病毒成分更可能是亲水性大分子而非精油。在本研究中，我们旨在从S. aromaticum中分离并表征富含羧基的多糖和糖蛋白，并系统地研究它们通过靶向感染过程中的病毒蛋白来抑制SARS-CoV-2的潜力。我们采用了多种结构表征方法（如HPGPC、GC–MS、HPLC、NMR）和机制测定方法（如酶抑制、SPR结合和基于细胞的抗病毒测定）来评估这些天然大分子的生物活性。本研究旨在阐明丁香来源多糖的结构-功能关系，并为其在抗SARS-CoV-2新药开发中的潜在应用提供分子基础。
材料与试剂
Syzygium aromaticum的干燥花蕾从安徽省亳州市的亳州中药饮片和药材厂获得。DEAE Sepharose Fast Flow和Sephacryl S-300 HR购自Cytiva（美国）。羧甲基纤维素（CMC）和碘甲烷购自TCI（东京，日本）。T系列Dextrans购自Amersham Pharmacia Biotech（英国）。标准单糖购自上海麦克莱恩斯生化科技有限公司（上海）。
纯度、分子量和单糖组成分析
从干燥的丁香花蕾中提取的水提粗多糖922的产量为4.2%。通过阴离子交换色谱法，从922中获得了五种富含多糖的组分（9220S、92205S、9221S、9222S和9224S），其产量分别为0.03%、2.41%、0.32%、4.83%和1.50%。同时，还分离出了五种富含糖蛋白的组分（9220P、92205P、9221P、9222P和9224P），产量范围为0.17%至0.94%。这些组分表现出不同的分子量。
讨论
在这项研究中，我们首次发现从传统中药Syzygium aromaticum花中提取的粗酸性多糖922能够强烈抑制SARS-CoV-2的复制，抑制率为98.86%。实验结果支持了我们的假设，即某些酸性多糖可能具有抗SARS-CoV-2作用。此外，我们发现酸性多糖可能对结合3CLpro是必需的，但922中的糖蛋白可能也起着重要作用。
作者贡献声明
金灿（Can Jin）：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、软件使用、资源准备、方法学设计、实验实施、数据分析。
冯波（Bo Feng）：数据可视化、软件使用、数据管理。
窦鹏飞（Pengfei Dou）：数据可视化、方法学设计、实验实施、数据管理。
周圆（Yuan Zhou）：数据可视化、结果验证、实验实施、数据管理。
郭婷婷（Tingting Guo）：数据可视化、数据管理。
刘玉轩（Yuxuan Liu）：结果验证、数据管理。
丁雅琪（Yaqi Ding）：结果验证、软件使用。
李美霞（Meixia Li）：软件使用、数据管理。
陈霞（Xia Chen）：
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（项目编号：82341097）、上海市重大科技项目、关键新药创制与制造计划（项目编号：2019ZX09735001）、国家重点研发计划（科技部）（项目编号：2019YFC1711-000）、浙江大学资助的COVID-19应急研究项目（项目编号：2020XGZX080）以及上海市公共卫生专项（项目编号：2024GKM19）的支持。
