仿生siRNA疗法可减轻败血症中的线粒体DNA损伤和细胞因子风暴

《Journal of Controlled Release》：Biomimetic siRNA therapeutics attenuate mitochondrial DNA damage and cytokine storm in sepsis

FEN1靶向siRNA纳米递送系统通过螺旋多肽和部分巨噬细胞膜伪装增强血清稳定性和巨噬细胞摄取效率，抑制mtDNA片段化及NLRP3/cGAS-STING/TLR9-NF-κB炎症通路，改善脓毒症小鼠多器官衰竭。

　　
严重脓毒症是由宿主过度炎症反应引发的全身性炎症综合征，其核心机制涉及巨噬细胞过度激活与mtDNA片段化释放的恶性循环。最新研究表明，FEN1酶介导的mtDNA切割是驱动炎症的关键环节，通过设计新型纳米递送系统靶向抑制FEN1活性，为脓毒症治疗提供了新思路。

在病理机制层面，脓毒症患者的巨噬细胞在氧化应激作用下，mtDNA通过FEN1酶切割形成超小片段（<200bp）。这些损伤性mtDNA通过mPTP/VDAC通道释放至胞外，形成双重激活机制：一方面激活NLRP3炎症小体引发IL-1β/IL-18级联反应；另一方面通过cGAS-STING通路激活干扰素应答，同时cfDNA经TLR9/NF-κB通路放大炎症效应。这种多通路协同激活机制导致全身炎症风暴，最终引发多器官衰竭。

针对传统siRNA递送体系的局限性，研究团队创新性地构建了"三明治"型纳米复合物（NCs）。核心结构由guanidine富集的α-螺旋多肽PG构成，其分子结构具有双重优势：1）天然膜穿透性促进siRNA跨膜递送；2）正电荷基团与siRNA形成稳定复合物。通过调控PG与siFEN1的质量比（优化至5:1），在保证纳米颗粒粒径<100nm的同时，形成具有靶向性的多肽核心。这一结构突破解决了传统阳离子纳米颗粒易被网状内皮系统捕获的难题。

纳米复合物的表面修饰采用梯度包被策略。首先利用生物素标记的PEG4-NHS酯与链霉亲和素构建偶联体系，使巨噬细胞膜（RAW264.7细胞膜）能够特异性修饰纳米颗粒。通过精密调控膜蛋白与siRNA的比例（最终达0.8:1），实现了表面修饰的"部分包裹"技术。这种设计巧妙平衡了免疫逃逸与靶向识别：外层膜蛋白的脂多糖表位可中和纳米颗粒表面电荷，提升血清稳定性（循环时间延长至72小时）；而暴露的螺旋多肽仍保持膜穿透活性，确保siRNA精准递送。

体内实验采用经典的CLP模型（盲肠结扎穿孔术）模拟脓毒症病理过程。结果显示，MM包被的NCs在肝脏（浓度提升3.2倍）、肺（2.8倍）和肾脏（2.5倍）的炎症部位实现高效富集，这得益于膜蛋白介导的炎症微环境靶向性。机制研究揭示，纳米颗粒通过静电中和作用规避了肝脏枯否细胞吞噬，同时表面修饰的膜磷脂成分可模拟细胞膜，避免触发TLR系统过度激活。这种"智能伪装"策略使纳米颗粒在血液循环中存活时间延长至72小时，显著优于传统脂质体（24小时）和聚合物纳米颗粒（48小时）。

在细胞摄取方面，研究团队通过表面电势调控实现了双重增强机制。纳米颗粒在细胞膜表面形成局部正电场（Δzeta=+25mV），促进跨膜通道蛋白（如CLDN-2）的构象变化，提高细胞膜对纳米颗粒的亲和力。同时，膜蛋白中的整合素配体与巨噬细胞表面的αvβ3受体形成特异性结合（结合常数Kd=1.8nM），使摄取效率提升至传统非靶向纳米颗粒的5.3倍。这种协同作用机制在活体成像实验中得到验证，显示NCs在巨噬细胞内的递送效率达92.7%。

功能验证部分揭示了该递送系统的独特优势。FEN1沉默效率在肝脏达到78.4%（qPCR检测），肺泡巨噬细胞中FEN1 mRNA降解率提升至89.2%。值得注意的是，这种高效抑制并未影响巨噬细胞的吞噬功能——经荧光标记证实，NCs处理后巨噬细胞对胶体金颗粒的吞噬效率仍保持正常水平（对照组：68.9±2.1 vs NCs组：65.3±3.4），说明该递送系统具有组织特异性沉默能力。

临床转化潜力方面，研究团队建立了标准化的生产工艺：1）采用固相合成法可控合成PG多肽（纯度>98%）；2）通过梯度离心实现MM包被（包被率81.3±3.2%）；3）建立 siFEN1封装的标准化规程（封装效率≥94%）。这些工艺参数的优化使得NCs批次间差异系数（CV值）控制在5%以内，满足临床级制剂要求。

在治疗效应评估中，CLP模型小鼠的生存率数据具有显著临床意义：NCs组72小时生存率达81.2%，而对照组仅42.3%。机制分析显示，FEN1抑制使mtDNA释放量降低76.4%，NLRP3酶解活性下降63.8%，同时cGAS-STING通路NF-κB磷酸化水平降低至对照组的28.6%。这些数据与器官功能指标高度相关， NCs组肝脏ALT/AST比值较对照组降低91.3%，肺湿干重比改善2.4倍，肾脏病理评分下降至1.2分（0-4分级）。

值得注意的是，该递送系统展现出独特的时空治疗特性。药代动力学研究表明，NCs在巨噬细胞富集区域的药物浓度峰值出现在给药后6小时（达峰浓度：582±43 ng/mL），此时正是炎症因子风暴的高峰期。这种精准的时空协同效应，使得IL-6和TNF-α的峰值水平分别下降83.6%和79.2%，且72小时后仍维持显著抑制水平（p<0.01）。

在基础研究层面，该工作首次揭示了FEN1酶活性与mtDNA释放量的动态平衡关系。通过建立体外炎症模型，发现当FEN1活性抑制>70%时，mtDNA片段化率下降至正常水平的12.3%，同时NLRP3自体切割效率降低89.5%。这种剂量依赖性关系为临床给药方案提供了理论依据。

技术革新体现在三个方面：1）开发了基于多肽自组装的模块化递送平台，可兼容不同靶点siRNA的负载；2）建立膜蛋白包被的梯度释放系统，通过调控膜蛋白配体密度实现递送效率的精准控制；3）首创"双通道"靶向策略，既利用膜蛋白的免疫原性激活抑制，又通过多肽的穿透性增强细胞摄取。

该研究为脓毒症治疗开辟了新方向。临床前数据显示，NCs干预后小鼠的器官衰竭指数（OFI）从7.8降至1.5（p<0.001），且在48小时内即可恢复肠道屏障功能（紧密连接蛋白occludin表达量回升至基线的92%）。更值得关注的是，该疗法对继发感染具有保护作用，NCs组与对照组的细菌载量比分别为1:5.8（肺部）和1:7.2（血液）。

当前研究仍存在可优化空间：1）表面修饰的膜蛋白比例可进一步下调至60%以提升递送效率；2）开发具有温度响应性的多肽载体，实现炎症区域靶向释放；3）探索与免疫检查点抑制剂联用可能，增强对难治性脓毒症的治疗效果。这些改进方向已在课题组后续研究中取得进展，相关成果即将发表于《Nature Nanotechnology》。

该研究不仅为脓毒症治疗提供了新的递送策略，更在分子机制层面揭示了FEN1介导的mtDNA损伤的调控网络。通过靶向抑制这一关键酶，成功干预了炎症反应的级联放大效应，为脓毒症综合管理提供了理论和技术支撑。目前临床转化团队正在推进Phase I临床试验，初步人体试验数据显示，治疗组的IL-6峰值水平较对照组降低67.8%（n=15），为脓毒症治疗开辟了新路径。