基于UPLC-MS/MS技术和网络药理学的柴胡加龙骨牡蛎汤抗抑郁作用研究

《Letters in Drug Design & Discovery》：UPLC-MS/MS and network pharmacology-based antidepressant study of Chaihu Jia Longgu Muli decoction

柴胡加龙骨牡蛎汤通过多靶点协同作用抑制抑郁的分子机制研究

　　
本研究以经典中药复方柴胡加龙骨牡蛎汤（CLMD）为对象，系统探究其治疗抑郁症的分子机制。通过整合超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）分析、网络药理学和分子生物学验证，首次揭示了CLMD中活性成分baicalin通过PI3K/AKT和MAPK/ERK双通路发挥抗抑郁作用的完整机制链条。

在化学成分解析方面，UPLC-MS/MS技术鉴定出CLMD水提物中共计63种有效成分，其中22种成分能进入血液循环。值得注意的是，核心活性成分baicalin的分子量（445.08 Da）和结构特征（5,8-二羟基-3-甲基黄酮）在质谱分析中表现显著特征峰，与已知的抗氧化和神经保护成分数据库高度吻合。特别值得关注的是，Rhein（大黄酸）和Luteolin（黄芩苷）等成分的代谢稳定性数据表明，这些化合物在体内代谢半衰期超过12小时，这为中药复方的长效作用提供了理论支撑。

网络药理学分析构建了"成分-靶点-疾病"三维模型，通过TCMSP数据库和SwissTargetPrediction平台预测的778个潜在靶点中，筛选出与抑郁症高度相关的472个核心靶点。PPI网络拓扑分析显示，PIK3R1、AKT1和MAPK1这三个核心蛋白节点度值分别达到8.2、7.8和9.1，显著高于其他靶点。值得注意的是，这三种蛋白在人类抑郁症患者脑组织中表达量较健康对照组平均降低37.6%-42.3%，其磷酸化水平与抑郁症状严重程度呈负相关。

分子对接实验通过AutoDock软件模拟发现，baicalin与PIK3R1的结合能最低（-10.3 kcal/mol），其分子结构中3',4'-二羟基苯并呋喃环与靶点α1亚基的磷酸化位点形成氢键网络（图7A）。特别值得注意的是，baicalin在MAPK1上的结合能（-10.1 kcal/mol）比常规抑制剂如U0126（-9.2 kcal/mol）更具优势，这可能是其抗抑郁作用的关键机制。分子动力学模拟显示，baicalin与AKT1形成的复合物在模拟条件下保持稳定构象超过10纳秒，而对照组在2.3纳秒时即出现构象崩溃，这为药物长效作用提供了分子动力学依据。

细胞实验部分采用皮质酮诱导的HT22细胞模型，发现当baicalin浓度达到4 μM时，细胞存活率恢复至对照组的92.3%，而同时期CORT组细胞存活率仅为68.4%。TUNEL染色显示，baicalin组细胞凋亡率较CORT组降低58.7%，且Western blot检测到p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-ERK/ERK的磷酸化水平分别上调2.1倍、1.8倍和2.3倍。值得注意的是，在8 μM剂量下，baicalin能显著抑制MDA生成（较CORT组降低64.2%），同时提升5-HT含量达37.8%，这与临床前研究发现的5-HT再摄取抑制效应相吻合。

机制研究揭示，CLMD通过多靶点协同作用激活PI3K/AKT通路：在细胞实验中观察到，当PI3K抑制剂LY294002存在时，baicalin的细胞保护作用被完全拮抗（IC50=3.2 μM vs对照组IC50=4.8 μM）。同时，MAPK/ERK通路被激活后，其下游的c-jun和ATF1蛋白表达量较CORT组降低41.2%和39.7%，证实了抗炎和抗氧化机制的存在。

研究还创新性地构建了"中药-靶点-通路"三维作用模型（图3）。该模型显示，CLMD的12味药材通过61种活性成分作用于42个关键靶点，形成包含PI3K/AKT和MAPK/ERK两大核心通路的网络体系。其中，甘草酸（Glycyrrhetic acid）与黄芩苷（Baicalin）形成协同作用，其联合效应较单一成分提升抗抑郁活性达1.8倍。

临床转化方面，研究团队通过HPLC-QTOF-MS/MS技术建立了CLMD的质量标准体系，检测到核心成分baicalin的纯度达到98.7%，且其含量与疗效呈正相关（r=0.82，p<0.001）。动物实验显示，连续给药14天后，CLMD组动物海马区BDNF表达量较模型组提升2.3倍，这与临床前研究发现的抑郁模型中BDNF水平下降37.5%的病理特征形成鲜明对比。

伦理审查方面，实验动物来源均通过国家实验动物伦理委员会（DWLLGZR202200023）认证，细胞培养实验符合《灵长类动物实验操作指南》要求。研究还特别关注了中药复方的安全性，通过检测给药14天后的SD大鼠肝肾功能指标（ALT、AST、BUN、Cr），发现CLMD组各项指标均优于模型组（p<0.05），证实该复方的临床安全性。

本研究的创新性体现在：首次系统解析CLMD的抗抑郁机制，发现其通过"baicalin-PIK3R1/AKT1-MAPK1"信号轴实现治疗，并建立包含12味药材的"药材-成分-靶点"三维数据库。特别是在分子对接部分，首次发现baicalin与AKT1的C202位点和MAPK1的T180位点的结合能差值超过2 kcal/mol，这为靶向治疗提供了新的分子手柄。

未来研究方向建议从三个方面拓展：首先，开展基于器官系统的网络药理学研究，重点解析CLMD对海马-杏仁核-前额叶皮层轴的作用；其次，开发baicalin纳米递送系统，利用其脂溶性特性（logP=3.2）设计自乳化纳米载体（粒径<100 nm）；最后，建立多组学联合分析平台，整合基因组学（WGS）、转录组学（RNA-seq）和代谢组学（LC-MS）数据，全面解析CLMD的分子作用网络。

本研究为中药现代化研究提供了重要范式，其发现的PI3K/AKT双通路激活机制，与现有SSRI类抗抑郁药的GABA受体调节途径形成互补。临床转化方面，建议采用HPLC指纹图谱（检测波长274 nm）对CLMD进行质量控制，并建立基于UPLC-MS/MS的快速检测方法（检测限0.1 μg/mL），为中药复方标准化提供技术支撑。