烟粉虱MEAM1隐种获毒后基因表达谱分析揭示TYLCV传播新靶点

《Scientific Data》：Gene expression differences in Bemisia tabaci following acquisition of an Old World begomovirus

本研究针对烟粉虱MEAM1隐种传播双生病毒的分子机制，通过设置12/36/60小时获毒期和12小时清肠期，采用核糖体RNA去除的RNA-seq技术，鉴定出37个差异表达基因（含2个植物源水平转移基因），为开发RNAi等基因组学介导的病毒防控策略提供了新靶点。

　　

在全球农业生产中，烟粉虱（Bemisia tabaci）堪称最具破坏性的害虫之一，它不仅通过直接取食危害作物，更是植物病毒传播的“超级媒介”。其中，由烟粉虱以持久循环式（persistent, circulative manner）传播的双生病毒（Geminiviridae），尤其是番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV），给番茄等经济作物造成毁灭性打击，常导致绝收。TYLCV引起的番茄黄化曲叶病（TYLCD）典型症状包括叶片向上卷曲、黄化、植株矮化、花器脱落及果实减产，对全球食品安全构成严重威胁。

烟粉虱并非一个单一的物种，而是一个由多个隐种（cryptic species）构成的复合群，其中中东-小亚细亚1（Middle East-Asia Minor 1, MEAM1）隐种是传播TYLCV效率最高的种类之一。病毒在烟粉虱体内的旅程十分精密：病毒粒子随植物韧皮部汁液被吸食，经口针、食道进入中肠滤室，在此浓缩后穿越至血淋巴，再在共生菌（如MEAM1体内的Hamiltonella defensa）产生的GroEL分子伴侣蛋白的保护下运抵唾液腺，最终随唾液注入健康植物，完成传播循环。

尽管前人已对烟粉虱获毒后的基因表达变化开展了一些研究，但针对MEAM1隐种响应TYLCV获取的转录组分析仍显不足，且不同研究报道的差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）数量差异巨大。这可能是由于实验方法的差异所致，例如使用植物插条而非盆栽植株、仅对特定组织（如中肠）进行测序，以及是否在获毒后设置关键的“清肠”步骤以排除取食感染植株组织带来的间接影响。此外，以往研究多采用poly(A)富集法构建RNA-seq文库，而核糖体RNA（rRNA）去除法（ribodepletion）已被证明能更有效地捕获稀有转录本和非poly(A)尾的转录本（如复制依赖性组蛋白mRNA和长链非编码RNA），可能提供更全面的基因表达视图。

为了解决上述问题，更精确地揭示TYLCV与烟粉虱MEAM1载体之间的直接互作机制，美国农业部农业研究局的Zachary Lahey、Alvin M. Simmons和Sharon A. Andreason等研究人员在《Scientific Data》上发表了他们的最新研究成果。他们设计了一个严谨的实验方案，采用盆栽TYLCV感染番茄植株作为毒源，设置了12、36和60小时三个获毒接入期（Acquisition Access Period, AAP），并在每个AAP后引入12小时在TYLCV非寄主植物羽衣甘蓝上的清肠期，以最大限度地减少植物组织质量差异对昆虫转录组的间接影响。随后，他们利用rRNA去除法制备链特异性RNA-seq文库进行高通量测序，并通过两种生物信息学方法（读段映射Read Mapping, RM和转录本定量Transcript Quantification, TQ）进行差异表达分析，旨在鉴定出真正由病毒获取本身所调控的关键基因，为未来开发基于基因组学的烟粉虱及病毒病防控新策略（如RNA干扰RNAi、CRISPR基因编辑）奠定基础。

关键技术方法概述

本研究的关键技术方法包括：1) 昆虫饲养与病毒传播体系建立：在温室条件下建立烟粉虱MEAM1种群，通过 clip cage（夹笼）技术在健康与TYLCV感染番茄植株间进行病毒传播实验，并通过终点PCR确认植物感染状态；2) 严格控制的白粉虱获毒实验：使用盆栽番茄植株，设置不同获毒时间（12/36/60小时）和统一的12小时清肠期（在非寄主羽衣甘蓝上），实验重复三次；3) 文库构建与测序：使用TRIzol法提取总RNA，通过QIAseq FastSelect试剂盒去除白粉虱及其内共生菌的rRNA，利用Illumina链特异性总RNA文库制备试剂盒构建文库，在NovaSeq 6000平台上进行2x150 bp双末端测序；4) 生物信息学分析：使用fastp进行原始数据质控，HISAT2过滤掉与线粒体、内共生菌基因组及rRNA数据库比对上的读段，STAR将剩余读段比对至MEAM1核基因组，分别通过读段计数（RM）和Salmon转录本定量（TQ）生成基因表达矩阵，最后使用DESeq2进行差异表达分析（调整后p值<0.1，最小倍数变化>1.2）。

研究结果

1. 高质量转录组数据集的获得

研究人员成功构建并测序了18个RNA-seq文库（6个处理组：健康/病毒处理 x 3个时间点，每组3个生物学重复）。平均每个文库产生约3250万条质控后的清洁读段，其中高达96.1%的读段能够唯一比对到烟粉虱MEAM1的核基因组上，表明数据集质量非常高，适合进行后续的差异表达分析。值得注意的是，带毒白粉虱文库平均比不带毒文库多产生约400万条读段。

2. 差异表达基因的鉴定

综合分析显示，在所有时间点和两种分析方法（RM和TQ）中，共鉴定出37个差异表达基因（DEGs）。其中，RM分析鉴定出13个DEGs（10个上调，3个下调），TQ分析鉴定出26个DEGs（8个上调，18个下调）。仅有2个基因（Bta05741和Bta05749）在两种分析方法中均被鉴定为差异表达。没有基因在超过一个时间点上表现出差异表达。特别值得注意的是，在72小时时间点，RM分析鉴定出两个上调的基因（Bta13103和Bta13961）被注释为从植物水平转移（horizontally acquired from plants）而来的基因，前者是rRNA N-糖苷酶，后者是类甜蛋白（thaumatin-like protein 1a）。其他差异表达的基因功能多样，包括逆转录酶（Bta15312，下调）、组蛋白H2A（Bta01272，下调）、组蛋白H2B（Bta05213和Bta02155，上调）、蛋白激酶C（Bta02612，下调）、细胞周期蛋白A1（Bta07538，下调）以及一些与泛素化、核糖体蛋白、代谢和信号转导相关的基因。

3. 技术验证确保可靠性

为确保结果的可靠性，研究人员进行了严格的技术验证。他们通过个体白粉虱提取物检测TYLCV，证实了不带毒处理组在所有时间点均为阴性，而带毒处理组在24、48、72小时的带毒率分别达到90%、93%和97%，表明病毒获取成功。此外，他们使用数字PCR（dPCR）技术对从RM和TQ分析中选出的一些上调和下调基因进行了表达量验证，结果与RNA-seq数据一致，进一步支持了差异表达结果的准确性。

结论与意义

本研究通过精心设计的实验（使用盆栽植株、设置清肠步骤）和先进的转录组学技术（rRNA去除法建库），系统地分析了烟粉虱MEAM1隐种在获取TYLCV后不同时间点的全基因组表达谱。研究成功鉴定出37个与TYLCV获取相关的差异表达基因，这些基因可能直接参与了病毒在虫体内的循环、存留或与宿主的互作过程。特别值得关注的是，发现了两个可能通过水平基因转移从植物获得的基因在病毒获取后显著上调，这为研究病毒-载体协同进化提供了新的线索。

该研究产生的高质量数据集（已存入NCBI BioProject PRJNA1096732）为科研社区提供了宝贵的资源。所鉴定的DEGs，尤其是那些功能未知的基因和水平转移基因，是未来深入研究TYLCV传播分子机制的优先候选靶点。通过针对这些关键基因开发RNAi或CRISPR等新型防控策略，有望干扰烟粉虱的传毒能力或其本身的生命活动，从而为减少由烟粉虱传播的病毒病造成的经济损失提供全新的、环境友好的解决方案。这项工作凸显了基因组学技术在农业害虫及其传播病害可持续治理中的巨大潜力。