球状链霉菌VITSMAB-2来源的蛋白酶抑制剂苯基氨基甲酸酯靶向SARS-CoV-2主蛋白酶的计算生物学研究

《Scientific Reports》：Computational insights into a protease inhibitor from Streptomyces globosus VITSMAB-2 molecular docking and dynamics simulations against SARS-CoV-2 main protease

本研究针对SARS-CoV-2主蛋白酶(Mpro)这一关键抗病毒靶点，研究人员从高海拔陆地环境分离获得球状链霉菌VITSMAB-2，通过分子对接和动力学模拟发现其代谢产物苯基氨基甲酸酯能稳定结合Mpro催化位点，ADMET分析显示其具备良好成药性，为开发新型冠状病毒抑制剂提供了有前景的先导化合物。

　　

在COVID-19疫情席卷全球的背景下，科学界对SARS-CoV-2病毒关键靶点的探索从未停止。病毒主蛋白酶(M^pro)因其在病毒复制周期中的核心作用而成为抗病毒药物开发的热门靶标。这种含有306个氨基酸的蛋白酶通过其半胱氨酸-组氨酸(CYS145-HIS41)催化二元体特异性切割病毒多聚蛋白，是病毒成熟不可或缺的关键酶。然而，现有抑制剂的开发仍面临诸多挑战，包括特异性不足、毒副作用大等问题，迫切需要从新颖来源发现结构新颖、作用机制独特的先导化合物。

正是在这一科学背景下，研究人员将目光投向了自然界中丰富的微生物资源——放线菌。尤其是栖息于独特高海拔生态位的放线菌，因其生存环境的极端性，可能进化出了独特的次级代谢途径，产生具有特殊生物活性的化合物。印度韦洛尔理工学院的研究团队从埃拉维库拉姆国家公园的高海拔土壤中分离得到一株具有蛋白酶抑制活性的放线菌，进而开展了一项结合微生物学、生物化学与计算生物学的综合研究，相关成果发表于《Scientific Reports》。

研究人员采用的主要技术方法包括：从高海拔土壤样本分离纯化放线菌；通过定性和定量蛋白酶抑制试验筛选活性菌株；运用超高效液相色谱(UPLC)和气质联用(GC-MS)技术鉴定活性成分；采用分子对接分析化合物与SARS-CoV-2 M^pro(PDB ID: 6Y2F)的相互作用；利用瑞士ADME等在线工具评估化合物的药代动力学特性；通过GROMACS软件进行100纳秒分子动力学模拟验证复合物稳定性。

3.1 样本采集

研究团队从印度穆纳尔埃拉维库拉姆国家公园(北纬10.1454°，东经77.0366°)的高海拔地区采集土壤样本，该地区位于西高止山脉，具有独特的生态系统特征。

3.2 放线菌分离

使用放线菌分离琼脂(AIA)和淀粉酪蛋白琼脂(SCA)培养基，通过涂布平板法从土壤样品中分离得到20株色素产生菌株，其中SMAB2菌株表现出最显著的蛋白酶抑制活性。

3.3 菌株鉴定与表征

通过形态学观察、扫描电镜分析和16S rRNA基因测序，将活性菌株鉴定为 Streptomyces globosus VITSMAB2(GenBank ID: PP809233.1)，系统发育分析确认其分类地位。

3.4 蛋白酶抑制活性评估

定性试验显示SMAB2对半胱氨酸蛋白酶(木瓜蛋白酶)和丝氨酸蛋白酶(胰蛋白酶)均有抑制活性，其中对木瓜蛋白酶的抑制活性更为显著。定量分析进一步证实SMAB2对木瓜蛋白酶的抑制率高达62.57%，对胰蛋白酶的抑制率为59.08%。

3.5 活性成分鉴定

溶剂萃取实验表明活性成分主要存在于有机相(抑制率60.29%)。UPLC分析获得纯度99.08%的活性组分，GC-MS鉴定主要成分为苯基氨基甲酸酯(含量47.23%)。

3.9 分子对接分析

分子对接结果显示，苯基氨基甲酸酯与SARS-CoV-2 M^pro的结合能为-4.5 kcal/mol，虽低于共结晶配体O6K(-7.5 kcal/mol)，但能有效结合于活性位点，与HIS163和GLU166形成氢键，并与包括催化关键残基CYS145在内的多个氨基酸产生相互作用。

3.10 成药性评价

苯基氨基甲酸酯分子量137.14 g/mol，符合Lipinski五规则零违反，具有高胃肠道吸收性、血脑屏障通透性和水溶性，LD₅₀为2.105 mol/kg，无AMES致突变性，显示良好的成药前景。

3.11 分子动力学模拟

100 ns分子动力学模拟表明，苯基氨基甲酸酯-M^pro复合物平均RMSD为0.344 nm，RMSF为0.179 nm，半径 of 回转(Rg)为2.20 nm，均优于未结合蛋白和O6K结合蛋白，表明复合物结构稳定。

研究结论表明，来自高海拔环境球状链霉菌VITSMAB2的苯基氨基甲酸酯是一种具有潜力的SARS-CoV-2 M^pro抑制剂。该化合物能有效结合于酶活性中心，特别是与催化关键残基CYS145相互作用，分子动力学模拟证实了复合物的稳定性。ADMET特性预测显示其具备良好的药代动力学特征。尽管结合能低于已知抑制剂，但其天然来源、新颖结构和稳定结合模式使其成为抗病毒药物开发的优秀先导化合物。

讨论部分指出，该研究首次报道了苯基氨基甲酸酯的蛋白酶抑制和抗病毒潜力，填补了该类化合物在抗病毒研究领域的空白。与已报道的M^pro抑制剂相比，苯基氨基甲酸酯具有结构简单、天然来源、合成可行性高等优势。在后疫情时代，针对保守病毒蛋白酶的抑制剂开发不仅对应对当前疫情有重要意义，更为未来冠状病毒新发突发传染病提供了技术储备和药物候选。

这项研究成功地将微生物资源挖掘、活性成分鉴定与计算生物学评价相结合，建立了从天然产物中发现抗病毒先导化合物的高效研究范式。苯基氨基甲酸酯作为一种新型M^pro抑制剂候选物，为后续的体外和体内实验验证奠定了坚实基础，也为基于天然产物的抗病毒药物开发提供了新思路。