针对达喀尔医院获得性耐多药肺炎克雷伯菌的广谱噬菌体vKpIN31和vKpIN32的特性研究

《Scientific Reports》：Characterization of broad host range bacteriophages vKpIN31 and vKpIN32 against hospital-acquired Klebsiella pneumoniae in Dakar, Senegal

本研究针对日益严重的医院获得性耐多药肺炎克雷伯菌（MDR K. pneumoniae）感染问题，从塞内加尔达喀尔污水样本中分离并系统表征了两株裂解性噬菌体vKpIN31和vKpIN32。研究证实二者具有广谱宿主范围、良好的热/酸碱稳定性、高效裂解活性及显著降解生物膜能力，基因组分析显示其不含毒力及耐药基因，安全性高，为开发新型抗菌疗法提供了极具潜力的候选资源。

　　

在当今全球公共卫生领域，抗生素耐药性（Antimicrobial Resistance, AMR）正演变为一场无声的危机，其威胁程度被预测可能在2050年超过癌症。在这场危机中，一组被统称为ESKAPE的病原体（包括屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌属）尤为棘手，它们对现有抗生素的抵抗能力日益增强。其中，肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）作为一种常见的条件致病菌，是医院获得性感染（Healthcare-Associated Infections, HAIs）的主要元凶之一，能引发败血症、肺炎、尿路感染等多种严重疾病。更令人担忧的是，耐多药（Multidrug-Resistant, MDR）和广泛耐药（Extensively Drug-Resistant, XDR）的肺炎克雷伯菌菌株不断出现，特别是碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（Carbapenem-Resistant K. pneumoniae, CRKP），与超过40%的高死亡率相关，使得临床治疗选择变得极其有限。

肺炎克雷伯菌的“盔甲”——多糖荚膜，不仅帮助它逃避免疫系统的攻击，还极大地促进了生物膜（Biofilm）的形成。生物膜是细菌聚集在一起并分泌胞外基质形成的保护性群落，如同一个坚固的堡垒，能显著降低抗生素的渗透效果，并上调细菌的耐药机制。面对传统抗生素逐渐失效的困境，科学家们正在积极寻找替代疗法，而噬菌体疗法（Phage Therapy）这一拥有近百年历史的古老概念正重新焕发生机。噬菌体是专门感染和裂解细菌的病毒，它们具有高度特异性、能够自我复制、并能与细菌共同进化，被认为是对抗MDR细菌感染的有力武器。

正是在这样的背景下，由Issa Ndiaye、Laurent Debarbieux、Ousmane Sow等来自塞内加尔达卡尔巴斯德研究所、法国巴黎巴斯德研究所等多个机构的研究人员组成的团队，在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究成果。他们致力于寻找能够有效对抗塞内加尔达喀尔地区医院环境中流行的MDR肺炎克雷伯菌的天然噬菌体。他们的研究聚焦于一个关键问题：能否从本地环境中找到安全、高效、且能对抗多种不同血清型（K型）肺炎克雷伯菌的广谱噬菌体？这对于开发适用于当地乃至更广泛区域的精准噬菌体疗法至关重要。

为了回答这个问题，研究人员从达喀尔多家医院及社区的污水进水口采集了样本，利用一株临床分离的肺炎克雷伯菌KP7作为宿主菌，成功分离出两株噬菌体，分别命名为vKpIN31和vKpIN32。研究团队随后对这两株噬菌体进行了全面而系统的表征，评估了它们的宿主范围、裂解效率、稳定性、复制周期、对抗生物膜的能力，并完成了全基因组测序分析，以确保其用于治疗的安全性。

本研究采用的关键技术方法主要包括：从临床标本中分离鉴定MDR肺炎克雷伯菌并进行抗生素敏感性试验（Kirby-Bauer纸片扩散法）；从环境污水样本中分离和纯化噬菌体（双层琼脂法）；测定噬菌体的宿主范围和裂解效率（点斑试验和效率铺斑测定，EOP）；评估噬菌体的热稳定性和pH稳定性；通过一步生长曲线（One-step growth）分析噬菌体的潜伏期和暴发量（Burst size）；利用体外培养模型评估噬菌体对浮游菌的裂解活性以及对预形成生物膜的清除效果；最后对噬菌体进行全基因组测序（Illumina平台）和生物信息学分析（包括基因注释、比较基因组学、毒力因子和耐药基因筛查等）。

2.1.噬菌体分离、纯化、宿主范围和EOP测定

研究人员从达喀尔Canal 4和Station de relevement (UCAD)的进水污水样本中，使用肺炎克雷伯菌KP7作为宿主菌，成功分离出vKpIN31和vKpIN32两株噬菌体。它们能形成清晰的噬菌斑。通过对28株临床分离的MDR肺炎克雷伯菌进行宿主范围测定，发现vKpIN31能有效裂解15株菌，覆盖12种不同的K基因座类型（K2, K7, K14, K15, K17, K22, K25, K27, K30, K37, K57, K102）；vKpIN32则能裂解12株菌，覆盖9种K型。效率铺斑（EOP）分析进一步表明，vKpIN31在其敏感宿主上的铺斑效率通常高于vKpIN32，其中KP2, KP6, KP7, KP9, KP17等菌株对两种噬菌体都表现出高度敏感性。这表明vKpIN31和vKpIN32是具有广谱宿主范围的裂解性噬菌体。

2.2.热稳定性和pH稳定性研究

稳定性是噬菌体能否应用于实际的重要指标。研究显示，vKpIN31在25°C和40°C下处理1小时，活性无显著下降，但在55°C及以上温度时活性显著降低，70°C时则完全失活。vKpIN32在25°C下稳定，但从40°C开始活性即出现显著下降，70°C时同样失活。在pH稳定性方面，两种噬菌体在pH 3到9的宽范围内均能保持稳定，但在强碱性条件（pH 12）下活性显著丧失。这些结果表明噬菌体在接近人体生理条件（37°C，中性pH）以及胃肠道可能经历的酸性环境下能保持良好稳定性，为其通过不同途径给药提供了可能性。

2.3.体外溶菌活性评估和暴发量

研究人员评估了噬菌体在不同感染复数（MOI为1, 10^-1, 10^-3）下对KP6, KP7, KP17三株菌的裂解效果。结果表明，与未处理的对照组相比，所有MOI下的噬菌体处理均能有效抑制细菌生长。值得注意的是，MOI为10^-3时显示出最高的裂解效能，并且相比更高的MOI，可能更不易诱导噬菌体抗性。此外，将vKpIN31和vKpIN32组合成鸡尾酒疗法使用时，对细菌的清除效果更佳，提示两者可能存在协同作用。一步生长曲线分析揭示，vKpIN31的潜伏期（Latent period）为25分钟，平均暴发量（Burst size）为281 PFU/细胞；vKpIN32的潜伏期更短，为20分钟，平均暴发量为246 PFU/细胞。较短的潜伏期和较高的暴发量表明这两株噬菌体具有快速、高效裂解宿主菌的能力。

2.4.噬菌体处理对细菌生物膜形成的影响

生物膜是感染难治的关键因素之一。研究评估了噬菌体对24小时和48小时成熟生物膜的清除能力。结果显示，vKpIN31和vKpIN32均能显著减少生物膜生物量。对于24小时的生物膜，减少幅度在18.6%到67.9%之间；对于48小时的生物膜，减少幅度在18.1%到58.7%之间。效果因菌株、噬菌体和MOI的不同而异。例如，对于KP17菌株24小时的生物膜，vKpIN31在MOI=1时效果不显著，但在MOI=10时有效。总体而言，两种噬菌体，特别是对48小时的成熟生物膜，都表现出显著的降解能力，这对于治疗与生物膜相关的慢性感染具有重要意义。

2.5.vKpIN31和vKpIN32噬菌体的基因组特征和比较基因组分析

全基因组测序表明，vKpIN31和vKpIN32均为线性双链DNA病毒，基因组大小分别为77,175 bp和107,104 bp，GC含量分别为45.01%和45.26%。vKpIN31预测有109个编码序列（CDS），其中46.7%与已知功能蛋白同源，53.2%为假设蛋白，并含有22个tRNA编码区。vKpIN32预测有174个CDS，64.3%为假设蛋白，含有20个tRNA编码区。功能蛋白涉及宿主细胞裂解（如内溶素、孔蛋白等）、结构蛋白（头、尾、连接件）、DNA/RNA/核苷酸代谢等。重要的是，生物信息学分析未在两个噬菌体基因组中发现与溶原性生活周期（如整合酶）、毒力因子、抗生素耐药性（AMR）基因或可移动遗传元件相关的基因，这表明它们作为治疗候选株的安全性较高。通过与国际病毒分类委员会（ICTV）数据库比对，两者均被归类为有尾病毒目（Caudoviricetes）、德米雷尔病毒科（Demerecviridae）、Sugarlandvirus属、Sugarlandvirus sugarland物种，与噬菌体Sugarland和vB_KppS-Storm亲缘关系最近。

3. 讨论

本研究分离并表征的两株噬菌体vKpIN31和vKpIN32，展现出对抗MDR肺炎克雷伯菌的巨大潜力。其广谱的宿主范围，特别是能覆盖包括K2, K14, K25等在内的多种重要致病K型，使其成为应对血清型多样性的医院感染的理想候选。良好的环境稳定性确保其在复杂的体内环境中能保持活性。高效的裂解能力（短潜伏期、高暴发量）意味着它们能快速控制感染。强大的生物膜降解能力则为其应用于导管相关感染等慢性生物膜感染场景提供了可能。

基因组分析是噬菌体疗法安全评估的核心环节。vKpIN31和vKpIN32基因组中不含任何已知的毒力、耐药或溶原性相关基因，极大地降低了水平基因转移的风险，符合治疗用噬菌体的安全标准。两者基因组中预测的多个尾部相关蛋白（可能包括降解荚膜的多糖解聚酶）可能是其广谱宿主范围的结构基础。基因组中数量较多的tRNA基因可能有助于其在感染不同宿主时优化翻译效率。

综上所述，这项研究从塞内加尔本地环境中分离出的vKpIN31和vKpIN32噬菌体，在对抗当地流行的MDR肺炎克雷伯菌方面表现出优异的特性。它们不仅作为独立的抗菌剂前景广阔，其鸡尾酒疗法展现的协同效应以及强大的抗生物膜能力，进一步提升了其应用价值。这些发现为开发针对西非地区乃至全球MDR肺炎克雷伯菌感染的噬菌体疗法提供了重要的候选资源和科学依据，是应对抗生素耐药性危机的一个积极步骤。未来的研究将需要进一步在动物模型和临床试验中验证其体内有效性和安全性。