超越结肠镜：粪便DNA突变筛查为结直肠癌早期检测提供新路径

《Scientific Reports》：Beyond colonoscopy, faecal DNA mutation screening provides a potential and viable path to early colorectal cancer detection

本研究针对丹麦结直肠癌（CRC）筛查中近60%结肠镜检查无治疗必要病变的问题，探索了基于粪便DNA的下一代测序（NGS）和数字PCR（dPCR）技术的筛查潜力。研究发现，尽管粪便中人源DNA含量低是主要挑战，但两种方法在DNA质量达标时均能可靠检测CRC相关突变（如KRAS G12D、BRAF V600E），dPCR在高质量样本中灵敏度达80%。该研究为开发非侵入性、精准的CRC筛查替代方案提供了重要依据，尤其适用于高风险人群。

　　

在全球范围内，结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）是发病率排名第三的恶性肿瘤，在丹麦同样如此。早期发现对于改善患者预后至关重要，因此许多国家都推行了筛查计划。丹麦自2014年起实施全国性结直肠癌筛查项目，邀请50至74岁的公民通过提交粪便样本来参与筛查。该项目目前主要采用粪便免疫化学测试（Fecal Immunochemical Test, FIT），通过检测粪便中是否存在潜血来提示风险。如果FIT结果阳性（定义为血红蛋白浓度≥100 ng/L），参与者将在14天内接受结肠镜检查作为后续确认手段。

然而，结肠镜检查作为一种侵入性操作，不仅给受检者带来不适，还存在一定的风险。更令人关注的是，来自丹麦西兰地区的数据显示，近60%因FIT阳性而接受结肠镜检查的个体，并未发现需要治疗的病变（如进展期腺瘤或癌）。这意味着大量的结肠镜检查可能是不必要的，造成了医疗资源的浪费和受检者的负担。此外，FIT检测依赖于检测粪便中的潜血，这对于本身存在可能导致胃肠道出血情况（如炎症性肠病、痔疮、接受抗凝治疗等）的个体而言，容易出现假阳性结果，从而进一步增加不必要的结肠镜检查。因此，开发一种不依赖于检测潜血、更为精准的非侵入性筛查方法，对于提高结直肠癌早期检测的效率、减少不必要的结肠镜检查具有迫切的需求和重要的意义。

正是在这样的背景下，发表在《Scientific Reports》上的这项研究应运而生。研究人员将目光投向了粪便中的另一种宝藏——人类DNA。由于结肠上皮细胞会不断更新脱落至肠腔，这些细胞所携带的DNA也随之进入粪便。如果肠道中存在结直肠肿瘤或癌前病变（腺瘤），这些病变组织脱落的细胞则会将其特有的基因突变信息带入粪便。因此，通过分析粪便中的人类DNA是否存在结直肠癌相关的基因突变，理论上可以实现对结直肠癌的非侵入性筛查和早期发现。

这项研究旨在评估两种基于粪便DNA的分子检测技术——下一代测序（Next-Generation Sequencing, NGS）和数字PCR（digital PCR, dPCR）——用于检测结直肠癌相关基因突变的可行性。研究人员希望探索这些方法是否能作为一种独立的筛查策略，不依赖于潜血检测，从而更特异地识别出真正需要结肠镜检查的高风险个体，为实现更加精准和个性化的结直肠癌筛查提供新路径。

为了开展这项研究，研究人员收集了2022年1月至2023年1月期间，在丹麦全国结直肠癌筛查项目中FIT检测呈阳性（≥100 ng/mL）的患者的粪便样本，所有参与者均签署了知情同意书。此外，还纳入了2例额外的结直肠癌病例和7份肿瘤活检样本用于比较和验证。研究采用的主要关键技术方法包括：1. 使用商业化试剂盒从粪便样本中提取总DNA，面临的挑战是粪便中人源DNA比例极低（通常<5%），绝大部分为微生物DNA。2. 下一代测序（NGS）技术：使用靶向测序 panel，覆盖了KRAS、APC、TP53、BRAF、PIK3CA等结直肠癌中最常发生突变的基因区域，在Illumina测序平台上进行测序，然后通过生物信息学分析识别体细胞突变。3. 数字PCR（dPCR）技术：使用针对6个特定结直肠癌相关单核苷酸变异（如KRAS G12D, G12V, G13D; BRAF V600E）的检测体系，在QIAcuity数字PCR系统上进行绝对定量检测，该技术特别适用于低丰度突变检测。4. 统计分析：将检测结果与结肠镜检查的“金标准”诊断结果进行比对，计算灵敏度、特异性、阳性预测值（PPV）等诊断性能指标，并分析不同病变分组（如癌、高风险腺瘤、中风险腺瘤、低风险腺瘤、无异样）之间的突变负荷差异。

结果

粪便DNA中结直肠癌相关突变的检测

研究成功从粪便样本中提取DNA并进行了突变分析。尽管面临粪便中人源DNA含量极低的巨大挑战（71个NGS文库中仅有3个达到了足够的测序覆盖深度），研究人员仍然在部分样本中检测到了结直肠癌相关的基因突变。通过NGS和dPCR两种方法，在成功分析的33例患者中，共检测到163个粪便DNA变异。其中，21个被归类为结直肠癌相关致病或可能致病性突变，例如著名的KRAS G12D和BRAF V600E突变。图2以热图形式直观展示了在所有粪便DNA样本中实际检测到的结直肠癌相关突变，并按基因和核苷酸变化进行了注释。这表明，尽管技术上有难度，但从粪便中检测与结直肠癌相关的体细胞突变是可行的。

突变负荷与临床诊断的相关性

分析发现，检测到的突变数量与结肠镜下的临床诊断结果存在显著关联。如图表3所示，需要治疗性病变（包括癌症、高风险和中风险腺瘤）的患者组中，平均检测到的突变数量（3.61个）显著高于无需治疗组（低风险腺瘤或清洁结肠，平均0.65个突变）。具体到不同诊断类别，高风险腺瘤患者平均突变数最高（5.9个），而低风险腺瘤患者平均突变数最低（0.1个）。这一结果具有重要意义，它表明粪便DNA突变检测不仅能够识别已形成的癌症，还可能捕获到癌前病变（腺瘤）的分子信号，这与筛查的早期发现、早期干预的目标高度一致。

NGS与dPCR检测性能比较

研究比较了NGS和dPCR两种方法的诊断性能（以结肠镜检查结果为金标准）。如表2和图5所示，NGS检测的特异性（100%）和阳性预测值（PPV, 100%）很高，但灵敏度相对较低（57.1%）。dPCR检测在所有样本中应用时，灵敏度为38.6%，PPV为94.4%。然而，当对dPCR检测应用严格的质量控制，只分析那些野生型（WT）分区数>200的高质量样本时，其灵敏度显著提高至80.0%，同时保持了较高的PPV（94.1%）。这突出表明，输入DNA的质量对检测结果的可靠性，特别是灵敏度，有着至关重要的影响。确保足够的、高质量的人源DNA是粪便DNA检测成功的关键。

粪便DNA与肿瘤活检突变谱的比较

研究人员还将粪便DNA中检测到的突变与配对的肿瘤活检组织中的突变进行了比较。图3显示了在常见结直肠癌驱动基因上，粪便DNA与肿瘤活检突变检测的一致性较高。这表明粪便DNA分析在相当程度上能够反映肿瘤组织的基因突变情况，有潜力作为肿瘤基因分型的一种非侵入性替代手段。当然，也存在部分不一致的情况，这可能反映了肿瘤的异质性或其他因素。

火山图分析展示突变富集情况

研究还采用了火山图（Volcano Plot）来可视化不同突变的富集程度和统计学意义（图4）。该图将突变的频率变化（效应大小，以log2FC表示）与其统计学显著性（-log10(p-value)）相结合。当仅使用本研究数据时（图4A），由于样本量较小，只有少数突变显示出显著的富集信号。当整合了来自权威癌症基因组数据库（如TCGA）和已发表文献中的突变频率数据后（图4B），统计功效增强，一些关键的结直肠癌驱动突变（如KRAS G12V, BRAF V600E, APC R1450）显示了显著的富集。图4C则通过引入模拟数据，构建了一个理想化的火山图分布作为视觉参考，有助于解读真实数据的模式。这种分析进一步支持了所检测突变与结直肠癌的相关性。

患者年龄与突变数量的关系

一个有趣的发现是，在本研究队列中，检测到的粪便DNA突变数量与患者年龄（50-74岁）之间存在微弱的负相关关系（R²= 0.05），即年轻患者中检测到的突变数量有略高的趋势（图6）。这与通常认为的体细胞突变随年龄累积的观念似乎不符。作者分析可能的原因包括：年轻患者可能因病变更活跃导致上皮细胞脱落更多；或年长患者样本DNA质量/产量问题导致检测灵敏度下降；也可能只是本队列中的偶然现象。这一发现虽不显著，但提示在制定筛查策略时，或需考虑年龄因素。

讨论与结论

本研究系统地评估了基于粪便DNA的NGS和dPCR技术在结直肠癌非侵入性筛查中的应用潜力。结果表明，这两种分子检测方法能够从粪便样本中可靠地检测出与结直肠癌发生发展相关的基因突变。尤其重要的是，突变负荷与病变的严重程度显著相关，高风险和中风险的癌前病变（腺瘤）也能被检测到信号，这为实现结直肠癌的早期干预和预防提供了可能。

dPCR技术在应用于高质量DNA样本（野生型分区>200）时，展现出了较高的灵敏度（80%）和阳性预测值（94.1%），显示出其作为筛查工具的良好前景。NGS技术则因其能够同时检测多个基因的多种突变，在发现未知突变和提供更全面突变谱方面具有优势。粪便DNA突变谱与肿瘤组织突变谱具有较高的一致性，进一步支持了利用粪便进行无创肿瘤基因分型的可行性。

然而，研究也明确指出了当前面临的主要挑战：从粪便中稳定获取足够数量和质量的人源DNA非常困难。粪便中绝大部分是微生物DNA，人源DNA含量低，加之样本保存、提取过程中可能存在的影响，导致许多样本无法获得可靠的检测结果。这是限制该方法灵敏度和广泛应用的关键瓶颈。未来的研究需要着重优化样本采集、保存缓冲液、DNA提取以及人源DNA富集的方法。

此外，结直肠癌具有遗传异质性，仅针对少数几个热点突变进行检测（如dPCR）可能会漏掉一部分患者。采用更广泛的基因Panel（如NGS）或能提高检测率，但也对技术和成本提出了更高要求。

综上所述，这项研究为粪便DNA突变筛查作为结肠镜和FIT之外的一种有前景的补充或替代方案提供了有力的证据。虽然目前在样本DNA质量方面还存在限制，使其尚不能完全取代现有筛查方法，但通过进一步的技术优化和标准化，粪便DNA检测有望在未来帮助更精准地识别需要结肠镜检查的高风险个体，从而减少不必要的侵入性检查，提高筛查效率，推动结直肠癌筛查向更加个性化、精准化的方向发展。这项研究为下一代非侵入性结直肠癌筛查技术的发展奠定了重要的基础。