动物园虎、狮与鬣狗中SARS-CoV-2的宿主内种群扩张、多样化与适应性进化

《Nature Communications》：SARS-CoV-2 within-host population expansion, diversification and adaptation in zoo tigers, lions and hyenas

本研究针对SARS-CoV-2跨物种传播后快速适应新宿主的进化机制这一关键科学问题，通过对丹佛动物园虎、狮、鬣狗暴发疫情的纵向样本进行深度测序分析，揭示了单一Delta亚系（AY.20）传播链中病毒宿主内种群扩张、多样化及正向选择特征，首次在鬣狗中发现N基因强正向选择信号及ORF1a E1724D、S T274I、N P326L等潜在适应性突变，为理解人畜共患病毒在新型宿主体内的快速进化规律提供了重要范例。

　　

当SARS-CoV-2（严重急性呼吸综合征冠状病毒2型）从动物宿主溢出到人类并引发COVID-19（冠状病毒病2019）大流行后，科学界很快意识到，这种病毒同样能感染多种动物物种。更令人担忧的是，病毒在动物群体中传播后可能发生进化，产生新的变异，并存在再次传回人类的风险，例如在白尾鹿、水貂和家猫中均有报道。因此，理解SARS-CoV-2在跨物种传播后如何快速适应新宿主环境，是评估其持续进化风险和制定有效防控策略的核心问题。然而，在自然环境中捕获病毒宿主转移初期的动态进化过程极具挑战性，相关研究多局限于实验感染模型。

2021年，美国丹佛动物园发生了一起SARS-CoV-2疫情，涉及东北虎（Panthera tigris altaica）、非洲狮（Panthera leo）和斑鬣狗（Crocuta crocuta）。这为科学家提供了一个难得的“天然实验室”，用以在真实世界中研究病毒在连续跨物种传播（从人类到虎，再到狮，最后到鬣狗）过程中的进化动力学。此前的研究已描述了疫情的流行病学特征，但病毒在宿主体内的遗传变异、选择压力及适应性突变等深层进化机制尚不清晰。为了回答这些问题，由科罗拉多州立大学的Laura Bashor和Sue VandeWoude等领导的研究团队，对疫情中的纵向样本进行了高深度测序和深入的生物信息学分析，相关成果发表在《Nature Communications》上。

研究人员主要运用了几项关键技术：对qRT-PCR（定量逆转录聚合酶链式反应）阳性及不确定的鼻腔拭子样本进行靶向扩增子测序，以获得高质量的SARS-CoV-2全基因组序列；利用生物信息学流程（如nf-core/viralrecon）进行病毒谱系鉴定、宿主内低频变异调用和变异注释；通过系统发育分析（使用Nextstrain软件）和单倍型网络构建来推断疫情传播路径；并采用SNPGenie等工具计算非同义（π_N）和同义（π_S）核苷酸多样性，以评估病毒种群的选择信号。

纵向高质量全基因组测序揭示病毒动态

研究团队对2021年10月至12月期间采集的63份生物样本（来自2只虎、11只狮和3只鬣狗）进行了高通量测序，成功获得了高质量的全基因组数据。纵向采样显示，狮子中病毒RNA（核糖核酸）检测持续时间较长，其中一只狮子（Lion B）在首次检测阳性60天后再次呈阳性。

SARS-CoV-2 Delta亚系AY.20在虎、狮、鬣狗间传播

系统发育分析表明，所有动物来源的病毒均属于Delta变异株的AY.20亚系，该谱系在同期科罗拉多州人类中的流行率极低（<1%）。病毒序列按物种形成簇状，狮子和鬣狗的病毒亲缘关系更近，且与老虎的病毒序列区分开来。单倍型网络分析结果与临床症状出现顺序（先虎，后狮，再鬣狗）一致，支持疫情很可能由单一溢出事件（可能源于人类）引发，并在动物间连续传播。

SARS-CoV-2宿主内序列变异指向宿主适应

通过以最早感染的老虎病毒共识序列为参考进行分析，研究人员在狮子和鬣狗样本中鉴定出14个独特的宿主内变异。值得注意的是，鬣狗样本中的遗传变异数量显著高于狮子。其中，核衣壳（N）蛋白的A254V突变在所有狮子和鬣狗样本中均固定存在，但在老虎样本中未见，提示其可能在传播早期出现并受到正向选择。此外，在鬣狗中鉴定出三个独特的非同义突变：ORF1a（E1724D，影响非结构蛋白nsp3）、刺突（S）蛋白（T274I）和N蛋白（P326L），这些可能代表了鬣狗特异的适应性突变。

宿主内病毒种群经历扩张、多样化及选择

对狮子纵向样本的分析显示，随着时间推移，病毒种群内的核苷酸多样性（π）和同义核苷酸多样性（π_S）均显著增加，表明病毒种群在宿主体内不断扩张和多样化。选择压力分析发现，49%的样本显示基因组水平的正向选择信号（π_N> π_S），51%显示纯化选择信号（π_S> π_N）。尤为突出的是，所有鬣狗样本均表现出强烈的基因组水平正向选择。分基因分析进一步揭示，N基因在所有物种的所有时间点均呈现强正向选择信号，S基因在多数样本中也显示正向选择，而ORF1ab区域则呈现混合的选择模式。

讨论与结论

本研究通过分析动物园疫情，生动展示了SARS-CoV-2在自然条件下发生连续跨物种传播后，在宿主体内快速进化以适应新环境的图景。疫情由一种在人类中罕见的Delta亚系（AY.20）引发，病毒在虎、狮、鬣狗间传播过程中，其种群在宿主体内迅速扩张并积累遗传多样性。研究人员检测到强烈的选择压力，特别是在鬣狗和病毒的N基因中。他们鉴定出四个候选的物种特异性适应性突变（狮子和鬣狗中的N A254V，以及鬣狗中的ORF1a E1724D、S T274I和N P326L），这些突变在公共数据库的人类序列中极为罕见，但N A254V突变在疫情同期科罗拉多州的人类AY.20序列中也有发现，提示了动物到人反向传播（spillback）的潜在可能性，尽管该谱系未在人类中持续传播。

研究表明，尽管此次疫情未产生令人担忧的新变异株，但病毒在非家养动物（尤其是鬣狗）体内表现出加速进化的迹象，遗传变异更丰富，选择压力更强。这强调了动物宿主作为病毒进化“试验场”的潜在重要性。N基因的强正向选择信号提示该蛋白在宿主适应中可能扮演关键角色，其突变（如位于二聚化结构域的A254V和P326L）可能影响病毒颗粒稳定性或与宿主因子的相互作用。鬣狗特异的S蛋白T274I突变则可能影响病毒与鬣狗ACE2（血管紧张素转换酶2）受体的结合或免疫逃逸。

总之，这项研究强调了在“一体健康”（One Health）框架下加强对动物中病毒监测的重要性。动物园等封闭环境为研究自然感染下的病毒进化提供了独特窗口。研究结果揭示，即使是一次性的溢出事件，SARS-CoV-2也能在新型动物宿主体内迅速积累适应性突变，凸显了持续监测易感动物种群对于预警潜在新型变异、防范新发传染病风险的必要性。