《Animal Reproduction Science》：Investigating the plasma membrane composition and osmotic tolerance of domestic felid (
Felis catus) spermatozoa as a model for non-domestic felids
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家猫精子渗透耐受范围及替代冷冻剂效果研究。实验表明猫精子在50-600mOsm/kg范围内膜完整性保持率>65%，胆固醇:磷脂比0.70且外源添加胆固醇无益。比较发现DMF（8%）解冻后活精子率（54%）显著优于甘油（24%）（P<0.05）。
艾米丽·A·卢戈（Emily A. Lugo）| 詹姆斯·K·格雷厄姆（James K. Graham）| 詹姆斯·D·吉利斯（James D. Gillis）| 詹妮弗·P·巴菲尔德（Jennifer P. Barfield）
科罗拉多州立大学生物医学科学系，美国科罗拉多州柯林斯堡，邮编80523
摘要
家猫（Felis catus）是研究非家猫繁殖的理想模型。通常，辅助生殖技术（如配子和胚胎的冷冻保存）首先在家猫物种中开发，然后应用于非家猫物种。膜组成和渗透耐受性会影响精子在冷冻保存过程中的存活能力。本研究调查了家猫精子的膜胆固醇含量及其渗透耐受范围，并在测试用于猫精子冷冻保存的替代冷冻保护剂和方法（添加胆固醇）时考虑了这些因素。最常用的猫精子冷冻保护剂甘油与甲酰胺（MF）、二甲酰胺（DMF）以及甘油与MF和DMF的组合进行了比较。为了验证渗透耐受范围，将家猫精子置于12种不同渗透压的溶液中（范围从0到1200 mOsm/kg）。通过流式细胞术分析，发现65%的精子在50至600 mOsm/kg的渗透压下膜结构保持完整，这表明家猫精子的渗透耐受范围较广。此外，家猫精子的胆固醇与磷脂比例相对较高（0.70），增加胆固醇含量并未提高其冷冻存活率。然而，替代冷冻保护剂DMF显著提高了解冻后活精子的比例（43%，而甘油仅为24%；P<0.05），其中8% DMF处理的精子解冻后活力高于5% DMF处理的精子（33% vs 54%；P<0.05）。这些发现强调了在改进猫精子冷冻保存方法时需要考虑的猫精子生理特性。
引言
精子冷冻保存是一种重要的辅助生殖技术（ART），常用于人工授精、体外受精和胞浆内精子注射（Kunkitti等人，2017年）。长期保存冷冻配子使得个体的遗传信息能够在其死亡后仍被利用（Cocchia等人，2010年）。对于基因库较小或分布在全球范围内的非家猫物种而言，使用冷冻保存的配子尤为重要。不幸的是，许多非家猫物种的配子冷冻存活率较低，因此需要进一步研究以优化特定物种的冷冻保存方案。此外，这些物种的配子往往难以获取，因此通常使用相关家猫物种的配子来模拟其对特定处理的反应。在这方面，家猫精子可作为非家猫物种的繁殖模型（Wildt等人，1983年；Lengwinat和Blottner，1994年；Pukazhenthi等人，2000年；Pukazhenthi等人，2006年；Amstislavsky等人，2018年；Swanson，2019年）。尽管猫精子的理想渗透压为290-320 mOsm/kg（Glover和Watson，1985年；Pukazhenthi等人，2002年；Pukazhenthi等人，2000年；Cocchia等人，2010年），但在添加和去除冷冻保护剂以及冷冻过程中水分转化为冰时，精子所经历的渗透压变化很大（Hammerstedt等人，1990年；Guthrie等人，2002年；Morris等人，2007年；Kunkitti等人，2017年）。验证精子对这些变化的耐受能力有助于改进冷冻保存方案，从而提高解冻后的存活率（Mocé等人，2010a；Mocé等人，2010b）。
甘油（3-7%）已被用于保存猫精子（Cocchia等人，2010年；Villaverde等人，2013年；Buranaamnuay，2017年；Amstislavsky等人，2018年；de Sousa Barbosa等人，2020年），但低分子量的冷冻保护剂（甲酰胺和二甲酰胺）在保存其他物种的精子方面也取得了成功，包括马（Vidament等人，2002年；Squires等人，2004年）、猪（Bianchi等人，2008年；Hwang等人，2009年）、犬（Futino等人，2010年）和蝙蝠（Hermes等人，2019年；Xiao-Kim等人，2025年）的精子。这些替代冷冻保护剂比甘油更易穿透精子膜，从而减少了精子在冷冻过程中经历的体积变化（Glazar等人，2009年）。
除了在添加和去除冷冻保护剂以及介质冻结和解冻过程中发生的体积变化外（Hammerstedt等人，1990年；Guthrie等人，2002年；Morris等人，2007年），精子膜在冷却过程中也会发生变化，尤其是在膜从液态转变为凝胶态时（Hammerstedt等人，1990年）。精子对“冷冲击”和冷却损伤的敏感性部分取决于膜中的脂质组成，尤其是胆固醇与磷脂的比例（Darin-Bennett和White，1977年；Holt，2000年）。通过使用载有胆固醇的环糊精增加精子膜中的胆固醇含量（Purdy和Graham，2004年），提高了多种物种精子的冷冻存活率（Lone，2018年；Mocé等人，2010a）。此外，用载有胆固醇的环糊精处理对冷冲击敏感的精子后，公牛和山羊的精子可以直接从室温进行冷冻保存，而无需先将其缓慢冷却至5 oC（Mocé等人，2014年）。
本研究旨在：1）验证家猫附睾精子的渗透耐受极限；2）确定胆固醇与磷脂的比例，以及用载有胆固醇的环糊精处理是否可以提高精子的冷冻存活率；3）研究使用替代的低分子量冷冻保护剂对猫精子的保护效果。
化学试剂
所有化学试剂均购自Sigma-Aldrich公司（密苏里州圣路易斯），除非另有说明。
动物伦理声明
用于收集精子的所有程序均无需动物护理和使用监督，因为提取精子的附睾是动物收容所绝育手术的副产品。
精子样本
精子的采集来自科罗拉多州柯林斯堡和佛罗里达州杰克逊维尔的动物诊所进行的常规绝育手术中的81只雄性家猫。这些猫属于不同的品种。
实验1：验证家猫附睾精子的渗透耐受性
家猫附睾精子具有较宽的渗透耐受范围（图1）。平均而言，在300 mOsm/kg的溶液中，88%的精子膜结构保持完整；在70至600 mOsm/kg的渗透压下，超过70%的精子膜结构保持完整。只有在非常低的（≤50 mOsm/kg）或非常高的（1200 mOsm/kg）渗透压下，膜结构完整的精子比例才低于70%。
实验2：载有胆固醇的环糊精（CLC）对猫精子冷冻存活率的影响
在各个阶段，用0或2 mg/mL CLC处理的猫精子的活精子比例相似。
讨论
在濒危物种中，尤其是在意外死亡的情况下，通常会进行死后的配子收集。在这种情况下，保存活精子的时间非常有限，且往往受到现有技术的限制。精子冷冻保存是一种可以用来保存、传播和利用家猫和野生猫物种宝贵遗传信息的工具（Buranaamnuay，2017年；Luvoni等人，2003年）。许多野生猫物种面临灭绝的威胁（Baillie等人，2004年）。
未引用的参考文献
(de Sousa Barbosa等人，2020年；SAS Institute Inc，2002年)
资助
本研究未获得公共部门、商业部门或非营利部门的任何特定资助。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究工作的财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢科罗拉多州柯林斯堡的Animal Friends Alliance和佛罗里达州杰克逊维尔的First Coast No More Homeless Pets提供的样本资源支持与帮助。同时，作者还要感谢Alexis Argil在实验室中的协助，以及Ann Hess博士对统计分析的审核。此外，还要感谢FL州Yulee的SEZARC的Linda Penfold博士对手稿的审核。
