《European Journal of Pharmacology》：Nobiletin Ameliorates Intervertebral Disc Degeneration by Upregulating HIF-1α to Inhibit Endoplasmic Reticulum Stress-Induced Apoptosis
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内质网应激诱导的细胞凋亡和 extracellular matrix 降解是椎间盘退行性病变的核心机制，nobiletin 通过上调 HIF-1α 表达抑制应激反应，在体外和动物模型中均显示显著保护作用。
作者：金阳灿|陈凯业|陈浩|丁华泽|陈贤鹏|姜瑞怡|余恒|林中科
中国浙江省温州市温州医科大学第二附属医院及玉英儿童医院骨科
摘要
椎间盘退变（IDD）是腰痛（LBP）的重要病因之一；然而，现有的治疗方法仍然不够充分。越来越多的证据表明，由氧化应激（OS）引起的内质网应激（ERS）会促进髓核细胞（NPCs）的凋亡和细胞外基质（ECM）的降解，这是IDD的重要病理机制。从柑橘皮中提取的多甲氧基黄酮类化合物诺贝汀（NOB）具有抗炎和抗氧化特性。然而，其治疗IDD的作用机制尚未得到充分研究。本研究旨在体外验证NOB对叔丁基过氧化氢（TBHP）诱导的ERS的保护作用，并在体内大鼠模型中验证其对IDD的保护作用。通过网络药理学和分子对接分析，发现HIF-1α是关键靶点，这一发现通过分子动力学模拟得到了进一步验证。使用Western blotting（WB）和免疫荧光（IF）检测体外蛋白质表达，TUNEL染色和流式细胞术分析检测凋亡情况。此外，利用针刺诱导的IDD模型，通过磁共振成像（MRI）、X射线、HE染色、番红花红O-快速绿（SO）染色和免疫组化（IHC）评估NOB的体内疗效。研究结果表明，NOB通过上调HIF-1α表达来抑制ERS，从而减少凋亡并延缓ECM降解。体内实验显示NOB可以改善IDD的进展。总之，这些发现表明NOB作为一种治疗IDD的新策略具有潜力。
引言
腰痛（LBP）是全球普遍存在的肌肉骨骼问题，是导致残疾和医疗支出的主要原因（Tolson等人，2024年）。主要风险因素包括衰老、肥胖和吸烟（Kabeer等人，2023年）。随着全球人口老龄化及肥胖率的上升，LBP的发病率预计将增加（Hartvigsen等人，2018年）。椎间盘退变（IDD）被认为是LBP的主要病理原因（Verrills等人，2015年）。椎间盘（IVD）在结构上无血管，由内部的髓核（NP）、外层的纤维环（OAF）和软骨终板（CEPs）组成（Wang等人，2023年）。髓核作为IVD的主要承重部分，其细胞的存活对于维持IVD的完整性至关重要（Mohd Isa等人，2022年）。髓核细胞（NPCs）数量的减少和细胞外基质（ECM）的降解是IDD发展和进展的标志性特征（Li等人，2022年）。
内质网（ER）是一种复杂的细胞内膜结构，由相互连接的管状结构、扁平囊泡和储存区组成，主要参与蛋白质和脂质的合成、加工、包装和运输（Chen等人，2023年）。氧化应激（OS）会破坏内质网的稳态（S. X. Zhang等人，2024年），导致错误折叠或未折叠蛋白质的积累，从而激活未折叠蛋白反应（UPR），最终引发内质网应激（ERS）（Tang等人，2022年）。ERS激活后，ATF6、IRE1α和PERK信号通路可启动凋亡以恢复细胞平衡（Marciniak等人，2022年）。因此，最近的研究越来越多地关注ERS介导的凋亡抑制作为IDD的治疗策略（Schwarz & Blower，2016年）。
缺氧诱导因子-1（HIF-1）是一种由α（HIF-1α）和β（HIF-1β）亚基组成的转录因子（Chen等人，2022年），在缺氧条件下激活下游基因以维持能量代谢和细胞存活（Kierans & Taylor，2021年）。髓核组织特有的缺氧和无血管微环境表明HIF-1α在IDD病理生理学中起着关键作用。先前的研究表明，缺氧和HIF-1α可以减弱NPCs中的ERS反应（Novais等人，2021年）。因此，HIF-1α成为IDD早期干预的有希望的生物标志物和治疗候选物（He等人，2021年；Su等人，2025年）。
诺贝汀（NOB）是从柑橘皮中提取的多甲氧基黄酮类化合物，具有抗氧化（Keshtkar等人，2019年；Liu等人，2019年）、抗糖尿病（Nguyen-Ngo等人，2020年）、抗炎（Lin等人，2019年）和抗纤维化作用。研究表明，NOB可通过抑制ERS来改善冠状动脉疾病（B. F. Zhang等人，2019年）和肾脏疾病（Song等人，2021年）。然而，关于NOB治疗IDD作用的研究尚缺乏。因此，本研究旨在探讨NOB对叔丁基过氧化氢（TBHP）诱导的NPCs凋亡（Wu等人，2021年）和ECM降解的保护作用，探索其作用机制，并在IDD大鼠模型中评估其治疗效果。
试剂和抗体
诺贝汀（CAS号：478-01-3，纯度>99%）购自MCE（中国上海）。II型胶原酶、DMOG和PX-478购自MedChemExpress（美国新泽西州）。叔丁基过氧化氢（TBHP）和二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。针对Caspase-3（C-C3）、HIF-1α和Bcl-2的一抗购自Cell Signaling Technologies（美国马萨诸塞州丹弗斯）；BAX、胶原II和MMP13的一抗购自Abcam（英国剑桥）；p-PERK、PERK、p-eIF2α的一抗购自...
NOB对NPC存活率的影响
CCK-8检测评估了不同浓度下NOB的细胞毒性。在浓度高达40 μM时，细胞存活率未受显著影响（图1B）。使用40 μM NOB处理48小时后，细胞存活率没有显著变化（图1C）。在氧化应激条件下（40 μM TBHP），40 μM NOB处理24小时提供了最佳的细胞保护作用（图1D）。此外，NOB处理显著降低了这些条件下的细胞内ROS水平（图...
讨论
IDD的特点是椎间盘结构和功能的逐渐恶化（Wang等人，2025年）。其多方面的发病机制包括纤维环破裂、髓核脱水以及广泛的ECM降解，常导致疼痛、神经根受压和脊柱稳定性受损（Xiang等人，2023年）。目前针对椎间盘退变（IDD）的临床药物治疗仍局限于使用非甾体抗炎药进行症状管理...
CRediT作者贡献声明
余恒：撰写、审稿与编辑、监督。
陈贤鹏：数据可视化、正式分析。
林中科：撰写、审稿与编辑、资源协调、资金申请。
陈浩：正式分析。
陈凯业：撰写初稿、实验设计。
姜瑞怡：数据可视化、数据管理。
丁华泽：数据可视化、数据管理。
金阳灿：撰写初稿、方法学设计、概念构建。
未引用参考文献
Zhang等人，2024年；Zhang等人，2019年。
利益冲突声明
作者明确声明与本文无任何利益冲突。
伦理声明
本研究的动物实验已获得温州医科大学动物护理和使用委员会的批准。
资助
本研究得到了温州市科学技术局的支持（资助编号：Y20180031）。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
我们感谢温州医科大学骨科实验室提供的实验仪器支持。
