工程化HLA-G靶向细胞外囊泡纳米平台：精准药物递送增强癌症治疗的新策略

《Nature Communications》：Engineering HLA-G-targeted extracellular vesicles nanoplatform for enhanced cancer therapy through precise cancer drug delivery

本研究针对化疗药物靶向性差、毒副作用大等临床难题，开发了基于HLA-G靶向的细胞外囊泡（EVs）纳米递送系统。通过基因工程改造HEK293T细胞，使其分泌表面展示抗HLA-G单域抗体（α-HLA-G Nb）的EVs，并负载化疗药物（如DOX、TMZ）。实验表明，该平台可精准识别HLA-G阳性肿瘤细胞，显著提升药物递送效率，在多种癌症模型（如三阴性乳腺癌、胶质母细胞瘤）中展现出强效抗肿瘤活性，且对正常器官毒性低，为精准癌症治疗提供了新思路。

　　

化疗是治疗侵袭性或转移性癌症的标准方法，但传统化疗药物在抑制癌细胞增殖的同时，也会损伤正常细胞，导致严重的副作用，甚至引发耐药性。尽管纳米载体（如脂质体）可改善药物递送效率，但其靶向性和生物相容性仍面临挑战。细胞外囊泡（EVs）作为内源性纳米颗粒，因其低免疫原性和天然递送能力被视为理想的药物载体，但天然EVs易被肝脏或脾脏捕获，难以富集于肿瘤组织。如何提升EVs的肿瘤靶向性，成为当前研究的焦点。

为解决这一难题，研究人员将目光投向人类白细胞抗原G（HLA-G）——一种在多种实体瘤（如三阴性乳腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌）中高表达的免疫检查点分子。此前研究证实，靶向HLA-G可实现对肿瘤的精准打击。基于此，本研究团队开发了一种创新性EVs工程化策略：通过基因工程改造HEK293T细胞，使其稳定表达融合蛋白α-HLA-G Nb-chimeric CD63，从而分泌表面展示HLA-G靶向单域抗体的EVs（α-HLA-G EVs）。这些工程化EVs可高效负载化疗药物（如阿霉素DOX、替莫唑胺TMZ、卡铂CBP），形成“导弹式”纳米药物递送系统（drug@α-HLA-G EVs），旨在实现肿瘤组织的精准药物递送。

研究的关键技术方法包括：利用基因工程构建稳定表达α-HLA-G Nb-chimeric CD63的HEK293T细胞系；通过切向流过滤和色谱法规模化纯化EVs；采用表面等离子共振（SPR）和纳米流式细胞术验证EVs的靶向性与药物负载效率；借助异种移植小鼠模型（如MDA-MB-231和U87细胞构建的肿瘤模型）及患者来源的原代肿瘤细胞模型，系统评估药物的体内外靶向性、抗肿瘤效果及安全性。

生成与表征α-HLA-G Nb表达EVs

通过质粒转染和稳筛获得工程化HEK293T细胞，其分泌的α-HLA-G EVs表面成功展示靶向抗体。SPR分析显示，α-HLA-G EVs与HLA-G的亲和力极高（K_D=7.18 nM）。纳米颗粒追踪分析（NTA）和透射电镜（TEM）证实EVs形态与尺寸（约93 nm）与天然EVs一致，且药物负载后未改变其物理特性。

α-HLA-G EVs对实体瘤细胞的靶向特异性

在MDA-MB-231（三阴性乳腺癌）、U87（胶质母细胞瘤）、SKOV3（卵巢癌）等高表达HLA-G的肿瘤细胞中，α-HLA-G EVs的摄取率显著高于正常细胞（如MCF10A乳腺上皮细胞）。共培养实验进一步验证其靶向特异性：超过90%的肿瘤细胞可内吞α-HLA-G EVs，而正常细胞摄取率不足2%。

药物负载α-HLA-G EVs的特性

负载DOX的α-HLA-G EVs（DOX@α-HLA-G EVs）在酸性肿瘤微环境（pH 6.4）中释放更高效，且缺氧条件可进一步促进药物释放。纳米流式检测显示约75%的EVs成功载药，Western blot证实EVs标志物（CD63、CD9等）表达完整。

α-HLA-G EVs封装化疗药物的体外抗肿瘤活性

在多种肿瘤细胞系中，drug@α-HLA-G EVs的杀伤效果显著优于游离药物或脂质体药物（如Lipo-Dox）。例如，DOX@α-HLA-G EVs处理MDA-MB-231细胞3天后，细胞死亡率超85%，并伴随ROS升高及凋亡标志物（Bax、cleaved Caspase-3）上调。此外，该体系对心肌细胞毒性显著低于传统化疗方案。

α-HLA-G EVs的体内靶向递送效能

在TNBC和GBM小鼠模型中，荧光成像显示DOX@α-HLA-G EVs在肿瘤组织富集强度是普通EVs的7倍，且心、肝、肾等器官损伤轻微。TUNEL染色证实其可有效诱导肿瘤细胞凋亡，并抑制增殖标志物Ki67表达。

α-HLA-G EVs封装化疗药物的体内治疗效果

DOX@α-HLA-G EVs显著抑制TNBC小鼠肿瘤生长，延长生存期至98天（对照组35天内恶化）。类似地，TMZ@α-HLA-G EVs在GBM模型中有效控制肿瘤进展，并保护脑组织完整性。

患者来源癌细胞对drug@α-HLA-G EVs的响应

原代乳腺癌和胶质母细胞瘤细胞（HLA-G阳性率超60%）对α-HLA-G EVs摄取率高，药物处理后细胞活性显著下降，验证了该平台在临床样本中的适用性。

本研究通过工程化EVs靶向HLA-G，成功构建了一种高效、低毒的肿瘤精准治疗平台。其核心优势在于：①利用HLA-G的广谱肿瘤特异性，突破传统靶向策略的局限性；②EVs的天然特性赋予其优良的生物相容性和低免疫原性；③药物在肿瘤微环境可控释放，最大化疗效并最小化副作用。该策略不仅为化疗药物递送提供了新思路，未来还可拓展至核酸药物或免疫调节剂的递送，有望成为个性化癌症治疗的通用平台。相关成果发表于《Nature Communications》，为EVs的临床转化奠定了坚实基础。