缺氧诱导的HMGB1通过Nrf2/HO-1通路调节NLRP3炎性小体/Caspase-1通路介导的心肌缺血再灌注损伤中的焦亡机制

《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Mechanism of Hypoxia-Induced HMGB1 Regulating NLRP3 Inflammasome/Caspase-1 Pathway-Mediated Pyroptosis in Myocardial Ischemia Reperfusion Injury Through the Nrf2/HO-1 Pathway

心肌缺血再灌注损伤（MIRI）中HMGB1通过抑制Nrf2/HO-1通路激活NLRP3炎症小体/Caspase-1通路介导的吡罗啉体，加剧心肌细胞损伤。体内外实验显示，低氧再灌注诱导HMGB1核到胞质转位，与Nrf2结合抑制其核转位及抗氧化通路，导致NLRP3、ASC、Caspase-1和GSDMD-N蛋白水平升高，IL-1β和IL-18分泌增加，心肌细胞活力下降，损伤加重。敲低HMGB1可逆转上述过程，而NLRP3激活部分抵消HMGB1沉默的益处。研究揭示HMGB1在MIRI中通过Nrf2/HO-1与NLRP3/Caspase-1双通路调控的机制。

　　
心肌缺血-再灌注损伤（MIRI）是急性心肌梗死恢复血流后常见的严重并发症，其机制复杂且涉及多途径交互作用。近年来，高迁移率蛋白B1（HMGB1）作为损伤相关分子模式被广泛关注，但其如何通过调控抗氧化与炎症通路共同介导MIRI的分子机制仍不明确。一项最新研究通过体外细胞模型和体内小鼠实验，系统揭示了HMGB1通过干扰核因子 erythroid-2相关因子2（Nrf2）/血红素加氧酶1（HO-1）抗氧化通路，激活NLRP3炎症小体/Caspase-1通路介导的吡罗白质炎（pyroptosis）在MIRI中的双重调控作用。

### 1. 研究背景与科学问题
心肌缺血-再灌注损伤的病理生理过程涉及多种细胞死亡机制和炎症反应的交互作用。尽管已有研究证实HMGB1在缺血-再灌注损伤中的促损伤作用，但其具体作用机制仍存在争议。例如，有研究显示HMGB1通过TLR4/NF-κB通路介导炎症反应，而另一些研究则指出HMGB1可能通过NLRP3炎症小体激活Caspase-1依赖的吡罗白质炎途径。此外，Nrf2/HO-1通路作为经典的抗氧化通路，在心肌保护中发挥重要作用，但其与HMGB1及NLRP3炎症小体的潜在关联尚未阐明。

### 2. 研究方法与实验设计
研究采用体外培养的小鼠心肌细胞模型和体内MIRI小鼠模型，结合多组学技术系统解析HMGB1的作用机制。体外实验通过建立低氧/复氧（H/R）模型模拟缺血-再灌注环境，利用shRNA技术敲低HMGB1表达，并通过小分子激动剂/抑制剂（如Nigericin激活NLRP3，ML385抑制Nrf2）验证通路特异性。主要检测指标包括：
- **细胞存活与损伤**：MTT法评估细胞活力，LDH检测细胞膜通透性。
- **蛋白表达与亚细胞定位**：Western blot分析Nrf2、HO-1、NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N及HMGB1的蛋白水平；免疫荧光（IF）和共免疫沉淀（Co-IP）技术观察Nrf2与HMGB1的相互作用及核转位。
- **炎症介质释放**：ELISA检测细胞上清中IL-1β和IL-18水平。
- **体内验证**：通过结扎小鼠左前降支（LAD）建立MIRI模型，结合TTC染色评估心肌梗死面积，HE染色观察心肌组织病理学变化，超声心动图检测左心室功能。

### 3. 关键发现与机制解析
#### 3.1 HMGB1在MIRI中的动态转位与功能
H/R处理导致心肌细胞HMGB1从核内转位至胞质和胞外，这一过程与细胞损伤程度呈正相关。HMGB1胞质化通过以下途径加剧损伤：
1. **抑制Nrf2/HO-1抗氧化通路**：HMGB1与胞质Nrf2直接结合，阻碍其向细胞核转位，导致下游抗氧化基因（如HO-1）表达抑制。这一机制通过Co-IP实验得到证实，且Nrf2抑制剂ML385可部分抵消HMGB1敲低的效果，表明Nrf2是HMGB1干预抗氧化通路的关键靶点。
2. **激活NLRP3炎症小体通路**：HMGB1胞质化通过结合NLRP3前体蛋白，促进Caspase-1活化及GSDMD-N介导的膜孔形成，最终释放IL-1β和IL-18等促炎因子。Nigericin（NLRP3激活剂）可部分逆转HMGB1敲低对炎症反应的抑制作用，证实NLRP3是HMGB1促炎效应的主要下游靶点。

#### 3.2 Nrf2/HO-1与NLRP3/Caspase-1通路的拮抗性调控
研究发现，HMGB1通过双重机制调控MIRI：一方面抑制Nrf2/HO-1通路，导致氧化应激水平升高；另一方面激活NLRP3/Caspase-1通路，放大炎症反应。这种双重调控在以下实验中得到支持：
- **Nrf2/HO-1通路抑制**：H/R处理后Nrf2核转位减少，HO-1表达下降，而HMGB1敲低可逆转这一现象。共定位分析显示HMGB1与Nrf2在胞质中形成复合物，抑制其核转位。
- **NLRP3/Caspase-1通路激活**：HMGB1通过促进NLRP3与ASC（凋亡相关斑点样蛋白）的寡聚化，加速Caspase-1的级联激活，最终导致GSDMD-N介导的膜孔形成和细胞裂解。Nigericin激活NLRP3通路可部分抵消HMGB1敲低对炎症的抑制作用，而Nrf2抑制剂ML385则通过抑制抗氧化通路间接增强炎症反应。

#### 3.3 体内实验的验证与病理机制
小鼠MIRI模型结果显示，HMGB1 Box A（HMGB1胞外抑制剂）预处理可显著改善心肌梗死面积（TTC染色）、左心室收缩功能（超声心动图检测LVFS/LVEF）及组织病理损伤（HE染色显示心肌细胞排列紊乱和纤维化）。蛋白组学分析进一步揭示HMGB1通过以下方式加剧损伤：
- **抗氧化防御削弱**：Nrf2核转位减少，HO-1表达下降，导致清除ROS能力减弱。
- **炎症级联放大**：NLRP3、ASC、Caspase-1和GSDMD-N蛋白水平升高，IL-1β和IL-18分泌量显著增加。

### 4. 理论创新与临床意义
该研究首次阐明HMGB1在MIRI中的双重作用机制：通过干扰Nrf2核转位抑制抗氧化反应，同时促进NLRP3炎症小体激活，形成“抗氧化-炎症”双轴失衡的恶性循环。这一发现突破了以往对HMGB1单一促炎作用的认知，为开发靶向治疗策略提供了新思路：
- **药物靶点选择**：开发HMGB1胞外抑制剂（如Box A）或Nrf2增强剂（如催化pol），可能通过协同作用减轻MIRI。
- **联合干预策略**：抑制HMGB1的同时激活Nrf2/HO-1通路，可能产生叠加保护效应。例如，在HMGB1敲低基础上补充Nrf2激动剂，可进一步抑制炎症小体活性。
- **临床转化方向**：研究显示HMGB1在心肌组织中的表达水平与MIRI损伤程度正相关，提示其可作为生物标志物用于早期诊断。此外，Nrf2/HO-1通路在缺血预处理中的 cardioprotection 作用已被证实，未来可探索HMGB1抑制剂与缺血预处理的联合应用。

### 5. 局限性与未来方向
尽管本研究揭示了HMGB1在MIRI中的核心调控作用，但仍存在以下局限性：
1. **时间窗口选择**：实验主要关注再灌注6小时内的动态变化，而MIRI的病理进程可能存在更复杂的时序特征。例如，HMGB1在缺血期释放可能触发不同信号通路。
2. **细胞类型特异性**：研究主要基于心肌细胞模型，未来需验证其在巨噬细胞、内皮细胞等心肌微环境中的一致性。
3. **分子互作网络**：HMGB1与Nrf2的相互作用可能涉及其他信号分子（如NF-κB），需进一步解析其调控网络。
4. **动物模型差异**：C57BL/6小鼠的遗传背景可能影响实验结果，建议扩展至其他品系或临床样本验证。

未来研究可沿以下方向深入：
- **单细胞测序**：解析MIRI中不同细胞亚群（如心肌细胞、巨噬细胞、中性粒细胞）中HMGB1表达与功能异质性。
- **空间转录组学**：结合单细胞分析，绘制HMGB1在心肌组织中的空间分布图谱及其与微环境互作关系。
- **临床前转化**：通过药代动力学优化HMGB1抑制剂（如Box A），并开展动物长期生存实验。
- **多组学整合**：结合代谢组学、蛋白质组学和转录组学，系统解析HMGB1介导的氧化-炎症双轴调控网络。

### 6. 总结与启示
该研究首次阐明HMGB1通过Nrf2/HO-1和NLRP3/Caspase-1双通路介导MIRI的分子机制。其核心发现包括：
1. HMGB1胞质化是启动炎症反应的关键步骤，而核转位受Nrf2调控。
2. Nrf2/HO-1通路与NLRP3/Caspase-1通路存在拮抗关系，HMGB1通过抑制前者间接激活后者。
3. 体内实验证实HMGB1抑制剂可显著改善心肌梗死面积和心脏功能。

这些发现不仅深化了对MIRI分子机制的理解，更为开发靶向HMGB1和Nrf2的双效治疗策略提供了理论依据。未来结合人工智能药物设计筛选新型抑制剂，并探索其与现有抗炎药物的协同效应，有望为MIRI提供更有效的干预手段。