视网膜血管损伤与修复过程中的非典型p38激酶信号传导

《The FASEB Journal》：Atypical p38 Kinase Signaling in Retinal Vascular Damage and Recovery

该研究通过构建Tab1敲入小鼠模型，发现非典型p38信号通路在氧诱导视网膜病变（OIR）中调控血管重塑和炎症反应。抑制该通路可减少血管剥夺和异常新生血管，同时增强生理性血管再生，揭示非典型p38通过调控Mef2c信号影响微胶质激活和血管稳态，为抗VEGF治疗提供新靶点。

　　
氧诱导视网膜病变（OIR）是一种由缺氧引起的视网膜血管损伤疾病，最终导致新生血管异常增生和视力丧失。尽管抗血管内皮生长因子（VEGF）疗法已广泛用于临床，但仍有部分患者疗效不足或出现耐药性，这提示需要探索其他致病机制。本研究通过构建Tab1敲入小鼠（Tab1KI），发现敲除特定p38信号通路（atypical p38）能显著减轻OIR相关的血管丢失和异常新生血管增生，为开发新型治疗策略提供了依据。

### 研究背景与核心问题
视网膜血管系统的失衡是OIR发展的关键环节。传统观点认为，VEGF信号通路是驱动血管异常增生的核心机制，但临床数据显示约30%的患者对VEGF抑制剂反应不佳。这表明可能存在其他信号通路参与调控血管损伤修复的平衡。p38丝裂原激活蛋白激酶家族在炎症和血管稳态中起重要作用，但其具体作用机制尚未完全明确。尤其是atypical p38通路，通过 TAB1蛋白与p38α的相互作用，可能参与血管损伤的病理过程。

### 实验方法与模型构建
研究团队采用C57BL/6小鼠构建Tab1KI突变体，通过基因编辑技术敲除TAB1蛋白与p38α的相互作用位点。实验分为两个阶段：
1. **高氧暴露阶段（pn7-pn12）**：将7天大的小鼠置于70%氧环境中5天，诱导视网膜血管退行性变（血管丢失）。
2. **复氧阶段（pn12-pn17）**：恢复至常氧环境，观察血管修复和新生血管形成。

样本处理包括：
- **视网膜平铺染色**：使用Isolectin B4标记血管，定量分析血管密度和新生血管 tuft数量。
- **免疫荧光与组织化学染色**：检测GFAP（星形胶质细胞）、CD31（血管内皮）、RBPMS（视网膜神经节细胞）等标志物。
- **RNA测序与转录组分析**：比较野生型（WT）与Tab1KI视网膜在基因表达谱的差异，结合GSEA富集分析通路。
- **Western blotting**：检测p38磷酸化水平、MKK3/6激活状态及TAB1磷酸化形式。

### 关键发现
1. **血管丢失与新生血管抑制**：
- Tab1KI小鼠在OIR模型中，血管丢失面积（从WT的15.7%降至5.9%）和新生血管 tuft数量（从8.3个/视网膜降至3.3个/视网膜）显著减少。
- 血管形态学分析显示，虽然血管扭曲程度与WT OIR组相当，但血管分支点数量和长度与WT RA组无差异，表明病理损伤修复未受影响。

2. **转录组特征与炎症微环境**：
- RNA测序显示，Tab1KI OIR视网膜在Mef2c信号通路相关基因（如Il6、Tnfα）表达显著高于WT OIR组。
- 微胶质激活标记物（Iba1）在Tab1KI组中未显著增加，但amoeboid（活化）型微胶质比例升高，提示局部炎症微环境重构。

3. **p38信号通路双轨调控**：
- **atypical p38抑制**：通过 TAB1突变阻断p38α自磷酸化，导致该通路活性降低，Mef2c转录因子表达减少。
- **经典p38激活增强**：MKK3/6依赖的p38经典通路在Tab1KI小鼠中反而增强，表现为p38磷酸化水平升高和MK2激活。

4. **血管再生与稳态的平衡**：
- Tab1KI OIR视网膜中，VEGF表达与WT组无差异，但VEGFR2（KDR）和Ang1（生理性血管生成因子）表达上调，Ang2（病理性血管生成因子）表达受抑制。
- 生理性血管再生相关基因（Dll4、Hlx、Elk4）在Tab1KI中表达增强，而病理性增殖标志物（Flt1、Mef2c）表达被抑制。

### 机制解析
研究团队提出“双轨p38调控假说”：
1. **atypical p38通路**：通过TAB1-p38α直接相互作用，激活Mef2c转录因子，促进血管内皮细胞异常增殖和 tuft形成。
2. **经典p38通路**：依赖MKK3/6的级联反应，调控炎症反应和血管修复。抑制atypical p38并未阻断经典通路，反而增强了其修复功能。

**关键证据链**：
- ** TAB1突变阻断atypical p38激活**：Western blot显示WT OIR视网膜中TAB1磷酸化水平升高，而Tab1KI组未出现此现象。
- ** Mef2c依赖性调控**：Tab1KI OIR视网膜中Mef2c表达降低，导致下游靶基因（如Il6、Cxcl10）表达减少，同时促进Elk4等生理性修复基因表达。
- **血管稳态的分子开关**： TAB1-p38α复合物通过调控Mef2c-CBFβ共激活因子（Mef2c-CBFβ）抑制血管再生中的过度增殖，同时允许经典p38通路介导血管修复。

### 临床转化意义
1. **治疗靶点开发**：
- atypical p38抑制剂可能作为抗VEGF疗法的补充，通过抑制Mef2c信号减少血管 tufting，而不影响生理性血管再生。
- 已有研究显示，p38抑制剂SB203580可部分抑制atypical p38活性，但会同时阻断经典通路，需开发选择性抑制剂。

2. **联合治疗策略**：
- 在抗VEGF治疗基础上，联合atypical p38抑制剂可能增强疗效。例如，针对Mef2c的基因编辑（如siRNA或CRISPR）已在体外细胞模型中显示潜力。
- 星形胶质细胞和微胶质细胞之间的信号交互可能成为新治疗靶点，如抑制Mef2c可减少促炎细胞因子释放。

3. **疾病模型创新**：
- Tab1KI小鼠为研究p38信号双轨调控提供了新模型，特别适用于区分病理性和生理性血管再生机制。
- 动物实验中发现的Ang1/Ang2平衡变化提示，抗纤维化治疗可能通过调节Angiopoietin信号增强疗效。

### 局限性与未来方向
1. **现有研究的局限性**：
- 实验仅在小鼠模型中验证，人类临床应用需更多转化证据。
- 未明确区分Mef2c对内皮细胞和神经胶质细胞的特异性调控机制。

2. **后续研究方向**：
- **分子机制**：解析TAB1-p38α复合物在细胞内的动态组装过程，以及如何通过染色质重塑影响Mef2c靶基因。
- **临床前试验**：评估atypical p38抑制剂在OIR和早产儿视网膜病变（ROP）模型中的疗效，特别关注耐药性患者。
- **生物标志物发现**：通过多组学整合分析，寻找区分病理血管新生与生理修复的特异性生物标志物。

### 总结
本研究首次在OIR模型中系统揭示了atypical p38通路的病理作用机制，证实其通过Mef2c信号调控血管异常增生。该发现不仅完善了p38在血管疾病中的双轨调控理论，更为开发选择性p38抑制剂提供了理论依据。未来研究可结合单细胞测序和空间转录组技术，进一步解析视网膜微环境中不同细胞类型对atypical p38激活的响应差异，为精准医疗提供新思路。