通过全基因组扩增技术，提高了定量聚合酶链反应（PCR）和下一代测序（NGS）在混合环境样本中检测沙门氏菌属菌株的灵敏度

《MicrobiologyOpen》：Improved Sensitivity of Quantitative Polymerase Chain Reaction and Next Generation Sequencing for Detection of Salmonella spp. in Mixed Environmental Communities Using Whole Genome Amplification

沙门氏菌低浓度环境样本中多重位移扩增（MDA）的检测效果及基因组代表性分析。通过qPCR和元基因组测序评估MDA在纯样本和混合微生物社区中的性能，发现MDA显著提升沙门氏菌的qPCR检测灵敏度（最低输入0.0001 ng DNA仍能检测），但在混合社区中导致基因组丰度低估（平均72.4%偏差）和taxa扩增偏差（如高GC含量的肺炎克雷伯菌丰度下降）。研究表明MDA适用于靶向检测，但需谨慎用于未经靶向的元基因组分析。

　　
### 多重位移扩增（MDA）在低浓度环境样本中沙门氏菌检测效能及局限性分析

#### 研究背景与意义
水环境中病原微生物的检测与基因组特征分析是公共卫生监测和疫情响应的关键环节。传统培养法耗时较长（如沙门氏菌培养需10天以上），且无法培养病毒、部分寄生虫等非培养微生物。近年来，基于二代测序的宏基因组学技术为环境病原体检测提供了新思路，但低丰度病原体（如仅占微生物群落0.1%的病原体）在测序中常因信号较弱而难以被有效识别。多重位移扩增（Multiple Displacement Amplification, MDA）作为一种全基因组扩增技术，可通过随机引物扩增显著提升低浓度模板的DNA产量，为后续靶向测序或qPCR提供高丰度模板。然而，MDA对复杂微生物群落中病原体检测的适用性仍存在争议，尤其是基因组代表性可能因扩增偏好性而受影响。

#### 实验设计与方法
研究团队采用标准化实验设计，通过模拟环境样本构建不同浓度的沙门氏菌（*Salmonella*）模板，并对比MDA处理前后的检测效能。具体方法如下：

1. **样本制备**
- **纯培养样本**：使用沙门氏菌LT2株纯培养DNA，按基因组拷贝数稀释至10?至101量级（对应DNA浓度0.1 ng至0.0001 ng）。
- **混合微生物模拟样本**：
- **Zymo标准混合社区**：包含已知的特定微生物组成（如标准化宏基因组参考混合物），其中沙门氏菌占比10%，其余为常见非病原微生物。
- **ATCC环境模拟样本**：通过向ATCC标准环境菌群中添加不同浓度的沙门氏菌DNA（占比0.1%-90.9%），模拟真实环境中病原体与背景微生物的比例差异。

2. **MDA扩增与检测**
- 使用Qiagen REPLI-g MDA试剂盒对上述样本进行扩增，通过Phi29 DNA聚合酶实现全基因组随机扩增。
- **qPCR验证**：以靶向沙门氏菌ttr基因的qPCR方法定量扩增后DNA浓度，评估不同初始模板的扩增效率。
- **测序分析**：采用Illumina MiSeq平台进行双端测序（2×250 bp），通过多基因组比对工具（FastQ-Screen）解析扩增后微生物组成，并计算覆盖率、GC偏差等指标。

3. **对照设置**
- 包含无模板对照（NTC）和阳性对照（如纯沙门氏菌DNA），以排除试剂污染和扩增效率差异。
- 非MDA测序对照组用于比较扩增对微生物组成的影响。

#### 关键发现与结果
1. **MDA对低浓度模板的扩增效能**
- **纯培养样本**：初始DNA浓度低至0.0001 ng时，MDA仍能产生≥584 ng/μL的扩增产物，基因组覆盖率≥73%（测序深度250,000×）。
- **qPCR定量验证**：所有样本中ttr基因拷贝数均实现显著提升（最高达10?倍），且与初始模板浓度呈正相关（R2=0.87）。
- **测序深度与覆盖率关系**：当测序深度≥500,000×时，纯沙门氏菌样本基因组覆盖率可达99%，但低浓度样本（<0.001 ng DNA）覆盖率下降至85%-88%，且GC偏差增大（CV值升高至1.2-1.5）。

2. **混合微生物社区中的扩增偏差**
- **Zymo混合社区**：10%沙门氏菌初始占比的样本经MDA后，实际相对丰度降至2.3%-6.4%，且非目标微生物（如链球菌属、单胞菌属）丰度异常升高。
- **ATCC环境社区**：当沙门氏菌初始占比≥50%时，基因组覆盖率≥90%，但占比≤10%的样本中，沙门氏菌测序覆盖率不足5%，且丰度显著低于预期（平均偏差72.4%）。
- **偏差影响因素**：
- **GC含量**：高GC基因组（如铜绿假单胞菌，GC=66.2%）在MDA后丰度下降最显著，而低GC基因组（如表皮葡萄球菌，GC=32.9%）丰度升高。
- **DNA输入量**：初始DNA浓度≤0.001 ng时，Φ29聚合酶的随机扩增易受模板不均一性影响，导致产物中非目标序列（如PhiX载体、大肠杆菌）占比升高（达7.1%-13.1%）。

3. **测序性能与基因组代表性**
- **纯样本优势**：在沙门氏菌纯培养样本中，MDA后基因组覆盖率和均匀性（CV值）显著优于混合社区，表明靶向扩增可有效排除背景微生物干扰。
- **混合社区局限性**：
- 即使初始沙门氏菌占比90.9%，MDA后其相对丰度仍降至63.8%，且无法通过简单调整测序深度（>1,000,000×）改善。
- 非目标微生物的扩增偏好性导致群落组成失真，例如微球菌属（*Micrococcus luteus*）丰度在ATCC社区中下降99.98%，而假单胞菌属（*Pseudomonas*）丰度升高10.8%。

#### 技术机制与偏差来源分析
1. **MDA扩增动力学**
MDA通过Phi29聚合酶的分支延伸机制实现指数扩增，但低模板量（<0.001 ng DNA）时，随机引物结合效率降低，导致扩增产物中短串联重复序列（STR）和引物二聚体比例升高，进而影响测序深度和准确性。

2. **扩增偏好的分子基础**
- **GC含量依赖性**：Phi29聚合酶在GC-rich区域（如基因间隔区）的延伸效率较低，导致高GC基因组（如*P. aeruginosa*）的扩增信号被抑制。
- **模板复杂性**：在混合社区中，非目标微生物的DNA竞争性结合引物，导致目标病原体（如沙门氏菌）的扩增效率被稀释，且不同物种的GC含量差异加剧了这一现象。

3. **测序深度与数据质量平衡**
- 测序深度≥500,000×时，纯样本的基因组覆盖率可达99%，但混合社区中低丰度病原体的覆盖率仍不足5%。
- 需通过多维度优化（如引物设计、扩增后纯化）解决低浓度样本的扩增效率与偏差问题。

#### 应用价值与改进方向
1. **适用场景**
- **高纯度目标微生物检测**：当病原体占比≥50%且DNA输入量≥0.001 ng时，MDA结合靶向测序（如ttr基因qPCR）可显著提升检测灵敏度，适用于饮用水安全监测等场景。
- **复杂环境样本预处理**：若后续需通过宏基因组学分析病原体，建议在MDA前采用选择性富集（如抗生素或代谢物处理）降低背景微生物丰度。

2. **技术改进建议**
- **优化扩增条件**：采用微流控技术（如微通道MAD）控制扩增起始模板量，减少随机偏差；或改用随机六聚体（6-mers）而非固定长度的引物（如PhiX174）以降低GC相关偏差。
- **多组学联合分析**：结合靶向测序（如16S rRNA基因）与宏基因组测序，通过双验证提高低丰度病原体检出率。
- **偏差校正算法**：开发基于机器学习的校正模型，利用已知微生物群落的参考基因组（如Zymo标准混合物）预测MDA后的丰度变化。

#### 结论与启示
本研究证实MDA在低浓度（≤0.001 ng DNA）沙门氏菌样本中的扩增效能，但其在复杂微生物群落中的适用性受显著限制：
1. **优势**：MDA可将0.0001 ng的沙门氏菌DNA扩增至5.7×10? ng（10?倍），为qPCR和靶向测序提供高浓度模板。
2. **局限**：
- 在混合社区中，病原体基因组代表性平均下降72.4%，且偏差程度与初始丰度成反比（丰度越低，偏差越大）。
- 测序深度需达到10?×以上才能实现高GC物种（如沙门氏菌）的完整覆盖，对设备成本和通量要求较高。

**未来研究方向**：
- 开发基于CRISPR-Cas12的即时检测系统，结合MDA富集技术实现环境样本中低丰度病原体的快速筛查。
- 探索非随机扩增策略（如基于特定代谢通路的选择性扩增）以提高复杂样本中目标微生物的扩增效率。

本研究为环境微生物组分析提供了重要参考，表明MDA在纯病原体样本和低背景干扰场景中具有显著优势，但在真实混合社区中需谨慎应用，建议结合其他分子方法（如数字PCR）进行互补验证。