莲花（Lotus japonicus）中的α-扩展蛋白EXPA1在根瘤菌的细胞内及细胞间定殖过程中被激活招募

细胞壁重塑蛋白α-扩展酶LjEXPA1在豆科植物Lotus japonicus共生体入侵和结瘤发育中起关键作用，通过非酶促机制促进感染室形成、穿透通道扩张及分生组织细胞分裂。突变体expA1-1和expA1-2在Mesorhizobium loti和Agrobacterium pusense两种入侵模式下均显示共生缺陷，表现为结瘤数量减少、体积变小及感染线程形成受阻。分子定位显示LjEXPA1在感染室、穿透通道及分生组织细胞壁特异性富集。该研究揭示了α-扩展酶在植物-微生物共生中的新型非催化功能，为共生调控机制提供了重要见解。

　　
豆科植物与根瘤菌共生过程中的细胞壁重塑机制研究

摘要：
本研究系统探究了α-扩压素基因EXPA1在豆科植物Lotus japonicus与根瘤菌共生过程中的关键作用。通过构建转基因植株，结合原位杂交、荧光显微镜观察和表型分析，发现EXPA1在共生菌的跨细胞（通过感染线程）和间细胞（不形成感染线程）两种感染途径中均发挥重要作用。基因沉默实验表明，EXPA1缺失会导致根瘤形成显著延迟和数量减少，同时影响共生菌的跨细胞穿透能力。分子定位显示该蛋白在感染腔室、跨细胞通道及细胞分裂活跃区域高度富集，提示其通过非酶促机制调控细胞壁松解。研究结果揭示了共生诱导过程中细胞壁动态重塑的分子调控网络，为解析共生互作机制提供了新视角。

引言：
氮素是植物生长的关键限制因子，豆科植物通过与根瘤菌建立共生关系实现氮素固定。这种互作涉及复杂的分子对话和细胞程序调控，其中细胞壁重塑是核心步骤。豆科植物存在两种根瘤菌感染途径：跨细胞感染通过形成管状结构（感染线程）实现，间细胞感染则通过表皮裂解直接侵入。尽管细胞壁重塑在共生过程中至关重要，但具体调控因子及其作用机制尚不明确。

研究显示，α-扩压素这类非酶促细胞壁松解蛋白在植物生长和病原防御中发挥重要作用。在模式植物Medicago truncatula中，GH9C2糖苷酶和NPL裂解酶协同作用形成感染线程，而α-扩压素EXPA1则负责维持感染腔室的结构稳定性。然而，在间细胞感染途径中，目前尚未明确相关细胞壁重塑蛋白的具体功能。本研究以共生模式植物Lotus japonicus为对象，系统解析EXPA1基因在两种感染途径中的功能特性。

实验发现：
1. **基因筛选与鉴定**：通过全基因组筛查和RNA测序，确定EXPA1是Lotus中唯一在两种感染途径中均显著上调的α-扩压素。其蛋白结构包含典型DPBB域和CBM63结合模块，具有典型α-扩压素特征。

2. **时空表达模式**：
- **早期阶段**（接种后1-3天）：EXPA1在表皮根毛变形区域和次生细胞壁形成部位显著表达，伴随共生菌的附着和初步入侵。
- **中期阶段**（接种后4-7天）：在跨细胞感染中，EXPA1富集于感染腔室（IC）和跨细胞通道（TPC）；在间细胞感染中，则主要分布于表皮裂解部位和感染口袋（IP）。
- **晚期阶段**（接种后7-14天）：在细胞分裂活跃区域（如根瘤原基）EXPA1表达达到峰值，与细胞壁重塑需求高度同步。

3. **功能验证**：
- **突变体表型**：EXPA1敲除突变体（expA1-1和expA1-2）显示以下特征：
* 根毛卷曲畸形率降低40-60%
* 感染线程形成数量减少90%以上
* 根瘤原基形成延迟3-5天
* 成熟根瘤体积缩小30-50%
- **共培养验证**：接种3周后，突变体中IRBG74的nodA基因拷贝数较野生型降低64-87%，证实其间的细胞定殖缺陷。

4. **分子定位**：
- 跨细胞感染中，EXPA1-YFP在感染腔室（IC）细胞壁和跨细胞通道（TPC）处形成连续荧光带，其定位与感染线程推进方向一致。
- 间细胞感染中，EXPA1在表皮根毛扭曲处和感染口袋（IP）的细胞壁呈现高浓度聚集，且与病原菌的定殖位置高度重合。

5. **作用机制**：
- 通过非酶促机制松解细胞壁，为共生菌提供物理通道
- 协调GH9C2糖苷酶和NPL裂解酶的活性，形成动态平衡的细胞壁重塑系统
- 在细胞分裂期通过调节细胞壁硬度促进共生菌的扩散

讨论：
1. **细胞壁重塑的时空特异性**：
研究发现EXPA1在不同感染途径中具有差异化的时空表达特征。跨细胞感染中，其作用集中在感染腔室和跨细胞通道的细胞壁松解；间细胞感染中则主要参与表皮细胞的机械重塑。这种分化可能与两种感染途径的物理过程差异有关：跨细胞感染需要连续穿透多个细胞层，而间细胞感染更依赖表皮细胞的被动裂解。

2. **共生相关蛋白的协同调控**：
- 与GH9C2糖苷酶形成功能互补：GH9C2负责降解细胞壁多糖，而EXPA1通过物理扩张维持细胞壁结构的完整性
- 与NPL裂解酶的协同作用：在感染线程推进过程中，EXPA1可能通过降低细胞壁机械强度，促进NPL对细胞壁的酶解作用
- 与SyPME1甲基酯酶的时空互补：甲基酯酶在感染腔室形成初期活跃，而EXPA1在后续的细胞壁重塑阶段发挥作用

3. **进化保守性与物种特异性**：
- 基因家族分析显示，豆科植物EXPA亚家族成员数量显著高于非豆科植物（如水稻仅含3个EXPA基因，而Lotus拥有9个），提示豆科植物共生系统对细胞壁重塑的深度依赖
- 物种特异性表达模式：在拟南芥中，EXPA4过表达增强病毒侵染，而在Lotus中EXPA1沉默导致共生缺陷，显示同源蛋白功能分化

4. **临床应用价值**：
- 突变体研究为开发共生增强型转基因植物提供理论依据
- 发现EXPA1在感染线程形成中的关键作用，为设计靶向细胞壁重塑的植物抗病策略提供新靶点
- 揭示共生诱导的细胞壁重塑具有双路径调控机制（跨细胞和间细胞）

研究局限与展望：
1. **基因功能验证**：目前仅验证EXPA1在共生过程中的必要性，其缺失是否完全阻断共生尚不明确，需通过共生菌回补实验验证
2. **作用机制解析**：EXPA1-CBM63模块的具体结合位点及机械扩张机制尚未阐明，需结合冷冻电镜和细胞壁组学进一步研究
3. **应用转化挑战**：外源扩压素基因的转化效率较低，需开发新型基因 delivery系统（如共生诱导型表达载体）
4. **生态适应性研究**：不同环境条件下（如低磷、干旱胁迫）EXPA1功能的动态变化仍需探索

本研究首次系统揭示α-扩压素在豆科植物共生中的双路径调控机制，为解析共生互作中的细胞壁重塑网络提供了关键分子节点。后续研究可聚焦于以下方向：
- 解析EXPA1-CBM63模块与细胞壁多糖的特异性相互作用
- 构建共生诱导的细胞壁重塑动态模型（时间-空间-分子三维模型）
- 开发基于EXPA1功能增强的作物共生固氮效率提升技术