MT@SiO2 可增强 MEK5-MAPK6-NAC32 介导的水杨酸合成，从而提高苹果对 Glomerella 叶斑病的抗性

硅基纳米材料负载melatonin增强苹果抗叶斑病能力及其分子机制

　　
苹果叶斑病（Glomerella leaf spot, GLS）是由真菌病原体 *Colletotrichum fructicola* 引起的毁灭性病害，严重威胁苹果生产。传统化学防治因抗药性、环境污染等问题受到限制，而植物激素褪黑素（melatonin, MT）在增强植物抗逆性方面展现出潜力，但其光不稳定性制约了实际应用。本研究通过开发硅基纳米材料负载的MT制剂（MT@SiO?），有效克服了MT的稳定性问题，并揭示了其调控植物抗病机制的分子网络，为可持续的病害管理策略提供了新思路。

### 研究背景与意义
苹果作为全球主要经济果树，其叶斑病导致叶片提前脱落、光合能力下降及异常花芽分化，直接影响产量和品质。尽管化学杀菌剂（如苯并咪唑类、硫代碳酸盐）可短期控制病害，但长期使用导致病原菌耐药性增强，且存在环境残留风险。植物内源激素MT通过调节氧化应激、次生代谢产物合成等途径增强抗病性，但其光降解特性限制了田间应用。因此，开发稳定纳米载体负载MT成为研究热点。

### 关键发现与机制解析
#### 1. 纳米载体显著提升MT的稳定性和生物效价
通过溶胶-凝胶法合成的硅基纳米材料（SiO?）具有高比表面积和均匀孔结构，可将MT负载于表面并形成稳定复合物（MT@SiO?）。实验表明，纳米载体使MT的光降解率降低80%以上，且在10-100 μM浓度范围内，MT@SiO?对GLS的抑制效果优于游离MT。其中，50 μM MT@SiO?处理使叶片病斑直径减少65%，且持续时间长达7天以上。

#### 2. SA信号通路的核心调控作用
转录组测序和蛋白质互作分析揭示，SA（水杨酸）代谢途径的关键基因 *MdPBS1/2* 在抗病中起核心作用。通过RNA干扰和过表达实验证实：*MdPBS1/2* 基因表达量与SA含量呈正相关（最高增幅达9.9倍），且受 *MdNAC32* 转录因子的直接调控。进一步研究发现，*MdNAC32* 基因启动子区域存在特异性结合位点，电泳迁移率-shift（EMSAs）和酵母双杂交（Y2H）实验验证了其直接激活 *MdPBS1/2* 表达的分子机制。

#### 3. MAPK激酶通路的级联调控
通过免疫共沉淀结合质谱（CO-IP MS）和双分子荧光互补（BiFC）技术，鉴定出 *MdMEK5*- *MdMAPK6* 信号模块。该模块通过磷酸化 *MdNAC32* 增强其转录活性：① *MdMEK5* 激酶激活 *MdMAPK6*；② *MdMAPK6* 进一步磷酸化 *MdNAC32*（ Ser/Thr位点）；③ *MdNAC32* 驱动下游SA合成基因（*MdPBS1/2*）表达。基因编辑实验显示，抑制 *MdMAPK6* 或 *MdNAC32* 均导致SA积累减少和抗病性下降。

#### 4. 纳米载体的协同增效机制
MT@SiO?不仅通过物理缓释增强MT活性，还通过以下途径协同抗病：① 纳米材料表面负电荷促进植物细胞膜离子通道开放，加速MT渗透；② 纳米载体保护MT避免光解，使其在叶片内持续作用；③ 纳米颗粒的机械刺激激活植物系统获得性抗性（SAR）信号通路。与单独使用MT相比，纳米制剂使SA含量提升至37.6 ng/g FW（对照组5 ng/g），且病斑抑制效果延长至15天以上。

### 技术创新与农业应用潜力
#### 1. 首创硅基纳米材料负载植物激素
研究团队采用溶胶-凝胶法合成多孔硅纳米颗粒（SiO?），通过表面羟基与MT的-NH?基团形成共价键（负载率15.7%）。该材料在模拟田间光照条件下（UVB辐射30分钟），MT保留率高达92%，显著优于传统微胶囊（<50%）。SEM和TEM表征显示，纳米颗粒粒径均一（50-80 nm），孔径分布集中在2-5 nm，适合植物细胞膜主动摄取。

#### 2. 分子机制图谱的构建
通过整合转录组测序（RNA-seq）、蛋白质互作组学（CO-IP MS）和基因编辑技术，首次解析苹果GLS抗性分子网络：
- **上游信号激活**：病原菌侵染触发MAPK激酶级联反应（*MdMEK5*→*MdMAPK6*），激活下游转录因子。
- **核心调控节点**：*MdNAC32* 基因通过直接结合 *MdPBS1/2* 启动子，调控SA生物合成酶活性。
- **负反馈调节**：SA积累通过磷酸化修饰MAPK激酶，抑制过度炎症反应。

#### 3. 品种改良的分子靶点
研究筛选出3个关键基因（*MdNAC32*、*MdPBS1*、*MdPBS2*），其中：
- *MdNAC32* 在野生型中表达量较低，但在过表达植株中使SA含量增加17.8倍，且病斑面积减少72%。
- *MdPBS1/2* 基因编辑（RNAi）导致SA合成能力下降83%，与感病表型完全吻合。
基于此，团队已建立基于CRISPR-Cas9的基因编辑平台，成功培育出抗病性提升40%的改良株系（‘GL-3’转接体）。

### 环境与经济效益评估
田间试验表明，喷施MT@SiO?（50 μM）可使苹果园叶斑病发生率降低至8.3%（对照组23.6%），且对已接种病原体的植株仍具有残留保护作用（持续有效期达30天）。与化学杀菌剂（如嘧菌酯）相比，纳米制剂减少用药量3-5倍，且未检测到土壤微生物群落结构变化，环境友好性显著提升。

### 局限性与未来方向
当前研究主要基于温室控制环境，未来需验证纳米制剂在真实田间条件下的稳定性（如高温高湿环境）和长期安全性。此外，虽然揭示了MAPK-NAC-SA调控轴，但具体磷酸化位点（如*MdNAC32*的Ser202/Thr205）及其对酶活性的影响仍需进一步解析。建议开展多组学整合分析（代谢组+蛋白质组），并探索纳米材料与其他植物源抗性诱导剂（如丁香酚、β-葡聚糖）的协同增效机制。

### 结论
本研究通过纳米技术破解了植物激素MT的稳定性难题，并首次系统揭示其通过MAPK-NAC-SA信号通路调控苹果抗GLS的分子机制。研究成果不仅为开发新型生物农药（纳米载药制剂）提供理论依据，更为分子标记辅助育种（如筛选高表达*MdNAC32*的种质资源）奠定基础。该技术路线已申请国家发明专利（专利号：ZL202510XXXXXX.X），并完成中试生产，计划2026年在贵州、陕西等主产区开展示范推广。