Brachypodium SPEECHLESS2 启动子驱动合成 EPF 的表达，从而降低甘蔗的气孔密度，且不会产生多效性效应

《Plant Biotechnology Journal》：Brachypodium SPEECHLESS2 Promoter Drives Expression of a Synthetic EPF to Reduce Stomatal Density in Sugarcane Without Pleiotropic Effects

气孔工程调控与副作用规避：甘蔗中特异性启动子驱动EPFsyn表达降低气孔密度同时避免 pleiotropic效应。

　　
该研究聚焦于通过调控气孔密度（Stomatal Density, SD）提升甘蔗（*Saccharum* spp.）的水分利用效率（Intrinsic Water Use Efficiency, iWUE）。气孔作为植物与外界环境交换气体和水分的关键结构，其密度直接影响植物的水分流失和光合作用效率。传统研究显示，通过过表达气孔发育相关基因（如EPF家族成员）可降低气孔密度，从而提升iWUE。然而，此类基因的泛表达常伴随 shoot architecture、光合能力和营养吸收的不可控变化，制约了实际应用。本研究通过筛选不同启动子（Promoters）对EPFsyn基因的时空特异性调控，验证了靶向表达在减少气孔密度同时避免副作用的可能性。

### 一、研究背景与意义
植物水分利用效率（WUE）受气孔密度、大小及开闭动态调控。C4植物（如甘蔗）因具备CO2浓缩机制，其WUE提升空间主要依赖气孔调控而非光合速率优化。然而，既往研究显示，通过泛表达EPF基因降低气孔密度时，常伴随叶片光合能力下降、茎秆形态异常及分蘖增多等副作用，主要归因于EPF基因的非靶向表达（pleiotropy）及其对ER/ERL信号通路的广泛影响。ER/ERL受体不仅参与气孔发育，还调控 shoot meristem分化、根构型及开花等关键过程。因此，筛选能精准限制EPFsyn表达于气孔发育区域的启动子，成为突破技术瓶颈的核心。

### 二、研究方法
1. **基因设计与表达系统**
构建三组表达载体：使用ZmUBI4p（玉米泛启动子）、BdCESA7p（拟南芥CESA7基因的启动子，原报道其表达于表皮细胞）和BdSPCH2p（拟南芥SPCH2启动子，已知特异性表达于叶原基发育区）。所有载体均携带EPFsyn基因，该基因由SbEPF2（高粱表皮形成因子2）与SbEPL9的融合序列构建，旨在通过竞争性抑制ER/ERL受体来阻断气孔原基分化。

2. **转基因植株培育与表型分析**
采用农杆菌介导转化法将重组质粒导入甘蔗愈伤组织，通过基因枪法（Biolistic Particle Delivery）转化后筛选出18个独立转化事件。从气孔密度（SD）、光合参数（CO2吸收速率、气孔导度）、叶片营养（氮含量、叶绿素含量）及生物量（分蘖数、茎秆高度与重量）四方面评估表型。

3. **时空特异性表达验证**
通过RT-qPCR检测不同组织（成熟叶、最幼节间、分生组织、气孔发育区）的EPFsyn表达水平。结合光学断层扫描（Optical Tomography）量化气孔分布模式（如细胞列密度、气孔间距），明确启动子对基因表达的时空控制能力。

### 三、主要研究结果
1. **气孔密度与分布模式**
所有表达EPFsyn的植株均显著降低气孔密度：UBI4p组降低23%，BdCESA7p组降低17%，BdSPCH2p组降低15%。值得注意的是，BdSPCH2p组通过减少气孔列密度（-8%）和单列气孔数量（-29%至-32%），而非单纯缩小气孔面积，实现SD调控。这种以“细胞列”为单位的气孔密度下降模式，与EPF家族通过竞争性抑制ER/ERL受体阻断气孔原基分化的分子机制一致。

2. **启动子特异性表达与副作用**
- **泛启动子（ZmUBI4p）**：EPFsyn表达覆盖所有组织，导致叶片叶绿素含量下降18%-25%，氮含量降低17%-19%，同时分蘖数增加22%，茎秆高度和生物量减少14%-16%。这些变化提示EPFsyn通过ER/ERL信号通路间接影响光合结构（如叶肉细胞分化）和营养分配。
- **BdCESA7p启动子**：虽然气孔密度下降幅度与UBI4p组相当（17%），但同样导致叶绿素和氮含量下降，并伴随茎秆缩短（-14%）及生物量减少（-16%）。表明该启动子虽具组织特异性，但未能完全限制EPFsyn在非目标组织的表达。
- **BdSPCH2p启动子**：EPFsyn表达局限于气孔原基发育区（叶片发育初期）和分生组织，未在成熟叶或茎秆中检测到显著表达。该组在气孔密度、光合参数及生物量方面均与野生型无显著差异，成功规避了副作用。

3. **气孔功能与光合参数关联性**
所有转基因植株的稳态光合参数（A_n、气孔导度g_sw）与野生型无显著差异。这表明气孔密度的适度降低（15%-23%）可通过扩大单气孔导度补偿，避免整体水分流失。但UBI4p组在低CO2浓度下（模拟干旱胁迫）显示A_n下降趋势，暗示长期水分胁迫可能加剧光合抑制。

### 四、机制分析与技术突破
1. **ER/ERL信号通路的时空特异性调控**
气孔发育依赖EPF-ER/ERL的浓度梯度信号。BdSPCH2p启动子通过时空精准定位表达，使EPFsyn仅在气孔原基分化的关键阶段活跃，避免了ER/ERL受体在其他组织（如茎分生组织）的干扰。这种“时空隔离”机制可能解释了为何BdSPCH2p组未出现营养吸收障碍或茎秆形态异常。

2. **启动子筛选的关键启示**
- **组织特异性并非充分条件**：BdCESA7p虽在表皮细胞特异性表达，但EPFsyn仍可能通过信号通路的级联效应影响邻近组织。
- **时空双特异性调控的必要性**：最佳效果需同时满足空间（气孔原基区域）和时间（发育初期）的双重特异性。BdSPCH2p的成功源于其仅在叶原基发育阶段启动表达，且避开分蘖和成熟茎叶组织。

3. **技术转化潜力**
该研究为C4作物（如甘蔗、玉米）开发高效低气孔品种提供了新范式。通过EPFsyn与BdSPCH2p的靶向结合，既实现了SD降低（-15%至-23%），又维持了正常光合能力和生物量积累。后续研究可探索不同C4作物中SPCH2p启动子的适用性，以及EPFsyn与其他气孔调控因子的协同效应。

### 五、局限与未来方向
1. **表达精准度待优化**
当前SPCH2p仍存在微弱的非靶向表达（如气孔原基周围组织），可能通过长期筛选获得更严格的启动子。合成生物学技术（如光控开关、CRISPR诱导的表达调控）或可进一步提升特异性。

2. **表型互作复杂性**
尽管未检测到光合参数异常，但UBI4p组在低CO2下的A_n下降趋势提示需结合环境因子（如土壤水分、CO2浓度）进行多场景验证。

3. **跨物种机制验证**
EPFsyn在甘蔗中的效应与SbEPF2在高粱中的表现存在差异（SD降低幅度更低），可能与EPF-ER/ERL互作因子的物种特异性有关。需通过结构域比对（如EPF的受体结合界面）解析功能差异。

4. **工程化推广挑战**
现有转化体系依赖农杆菌介导，难以大规模生产。未来需开发基于基因编辑（如CRISPR-Cas9靶向启动子元件）的精准编辑技术，结合多组学分析（转录组、蛋白互作组）优化设计。

### 六、结论
该研究首次通过启动子筛选实现EPFsyn的时空精准表达，为C4作物水分利用效率提升提供了可行路径。BdSPCH2p启动子成功将气孔密度降低15%的同时，维持了正常光合能力、营养吸收和生物量积累。这一发现不仅解决了EPF家族基因泛表达导致的副作用难题，更为其他C3/C4作物（如水稻、小麦）的气孔调控工程提供了方法论参考。后续研究需结合多组学技术解析ER/ERL信号在气孔发育与器官建成中的交叉调控网络，推动该技术从实验室走向田间。