CUL4B通过介导FUS降解促进肝细胞癌进展及奥沙利铂耐药的新机制研究

《Cell Death & Disease》：CUL4B promotes hepatocellular carcinoma progression and oxaliplatin resistance by facilitating FUS degradation

本研究针对肝细胞癌(HCC)奥沙利铂耐药这一临床难题，揭示了CUL4B/FUS/miR-143-3p/KRAS信号轴的关键作用。研究人员发现CUL4B通过CRL4BDTLE3连接酶复合物促进FUS蛋白的泛素化降解，进而抑制miR-143-3p成熟，激活KRAS信号通路，最终导致HCC进展和化疗耐药。该研究为HCC靶向治疗提供了新的理论依据和治疗靶点。

　　

肝细胞癌是全球范围内最常见的原发性肝脏恶性肿瘤，其发病率和死亡率居高不下，已成为癌症相关死亡的第三大原因。尤其令人担忧的是，大多数患者在确诊时已处于中晚期阶段，肿瘤恶性程度高、复发频繁、预后极差，严重威胁患者的生存期。以奥沙利铂为基础的化疗方案是目前不可切除肝细胞癌的标准治疗方法之一，虽然能够在一定程度上改善患者的生存状况，但其疗效往往受到固有或获得性耐药性的限制，这在肝细胞癌病例中发生率极高。因此，深入探索肝细胞癌进展和奥沙利铂耐药性的分子机制，寻找新的治疗靶点，成为当前肝癌研究领域亟待解决的关键科学问题。

在这一背景下，蛋白质neddylation修饰作为一种重要的翻译后修饰过程，引起了研究人员的广泛关注。Neddylation通过将NEDD8类泛素分子连接到底物蛋白的赖氨酸残基上，进而调控蛋白质的稳定性、活性和复合物组装。研究表明，neddylation通路的异常激活与多种人类癌症的发生发展密切相关，成为潜在的抗癌治疗靶点。作为neddylation最重要的底物之一，cullin家族蛋白是Cullin-RING E3泛素连接酶(CRLs)的核心支架组分，而CUL4B正是该家族中的重要成员。

CUL4B作为CRL4B E3泛素连接酶复合物的支架蛋白，通过与接头蛋白DDB1、RING结构域蛋白RBX1以及多种底物受体DCAFs组装形成功能各异的CRL4B复合物，通过催化底物蛋白的多聚泛素化降解或组蛋白H2A的单泛素化修饰，参与调控多种重要的细胞生物学过程。已有研究表明，CUL4B在乳腺癌、前列腺癌和膀胱癌等多种实体瘤中过度表达，并与肿瘤的发展和预后密切相关。然而，CUL4B在肝细胞癌中的具体功能及其在化疗耐药中的作用机制尚不完全清楚。

与此同时，microRNAs(miRNAs)作为一类非编码RNA分子，通过与其靶mRNA互补结合，导致翻译抑制或降解，在细胞分化、增殖、存活以及抗癌治疗耐药性中发挥着关键作用。由于能够同时调控信号网络中的多个基因，miRNAs已成为肿瘤生物学研究中的重要角色。其中，miR-143-3p作为一个公认的肿瘤抑制因子，在多种癌症中低表达并与不良预后相关。其抑癌作用主要归因于对KRAS等著名癌基因的直接靶向作用。然而，在肝细胞癌中，miR-143-3p表达的上游调控机制及其在奥沙利铂耐药中的功能尚未明确。

基于以上背景，研究人员在《Cell Death & Disease》上发表了最新研究成果，系统阐述了CUL4B通过调控FUS/miR-143-3p/KRAS信号轴促进肝细胞癌进展和奥沙利铂耐药的新机制。这项研究不仅揭示了肝细胞癌耐药的新机制，也为开发新的治疗策略提供了重要理论基础。

在研究方法上，研究人员综合运用了多种先进的技术手段：通过免疫组织化学(IHC)和原位杂交(ISH)对73例HCC组织芯片进行分析；利用CRISPR/Cas9技术构建稳定敲低细胞系；采用蛋白质印迹(Western blot)、实时定量PCR(qRT-PCR)等分子生物学技术检测基因和蛋白表达；通过细胞增殖(CCK-8)、凋亡(Annexin V-FITC/PI染色)和细胞周期检测等技术进行功能验证；使用免疫共沉淀(Co-IP)和体外泛素化实验验证蛋白质相互作用；借助生物信息学分析和大规模分子对接模拟揭示蛋白质结构特征；并通过裸鼠移植瘤模型进行体内功能验证。

CUL4B与miR-143-3p呈负相关，且高CUL4B/低miR-143-3p表达与HCC患者不良预后相关

研究人员首先通过MLN4924(一种NAE抑制剂)处理Huh7细胞并进行miRNA测序，发现61个miRNAs表达发生显著变化，其中miR-143-3p作为已知的肿瘤抑制因子引起了特别关注。实验证实，抑制neddylation激活的CRLs能够显著提高Huh7和LM3细胞中miR-143-3p的水平。通过特异性敲低各个cullin基因，研究人员发现只有CUL4B的敲低能够上调miR-143-3p表达。

对73例HCC组织和69例癌旁正常组织的分析显示，HCC组织中CUL4B显著上调而miR-143-3p相应下调，两者表达呈显著负相关。临床数据分析表明，高CUL4B或低miR-143-3p表达与患者总体生存率差显著相关，且同时具有高CUL4B和低miR-143-3p表达的患者预后最差。这些发现强调了CUL4B/miR-143-3p轴可能构成一个癌基因-肿瘤抑制因子级联反应，驱动HCC进展。

CUL4B敲低抑制HCC细胞生长并增加其对奥沙利铂的敏感性

功能实验表明，CUL4B过表达显著促进细胞增殖，而其敲低则抑制细胞生长。更重要的是，CUL4B过表达保护Huh7细胞免受奥沙利铂介导的生长抑制，而CUL4B敲低则增强了该药物的作用。CUL4B敲低降低了奥沙利铂在Huh7和LM3细胞中的IC₅₀值，增加了奥沙利铂处理后的细胞死亡，并通过增加Annexin V阳性细胞和凋亡相关蛋白NOXA、cleaved PARP的积累，使Huh7细胞对奥沙利铂诱导的凋亡更加敏感。细胞周期分析显示，CUL4B敲低细胞经奥沙利铂处理后G2期细胞比例显著增加，伴随Cyclin B表达下调。

CUL4B敲低通过上调miR-143-3p表达增强HCC细胞对奥沙利铂的敏感性

研究人员进一步探讨了miR-143-3p在HCC中的作用，发现miR-143-3p过表达显著抑制细胞生长，而其抑制则促进Huh7和LM3细胞增殖。在CUL4B敲低细胞中转染miR-143-3p抑制剂，可部分逆转CUL4B敲低在有无奥沙利铂处理情况下的生长抑制效应。

小鼠异种移植瘤模型实验进一步证实了这些体外发现。CUL4B敲低显著抑制肿瘤生长，而miR-143-3p抑制则显著逆转了CUL4B敲低诱导的肿瘤生长抑制。类似地，CUL4B敲低极大增强了Huh7细胞对奥沙利铂治疗的敏感性，而miR-143-3p抑制则修复了CUL4B敲低细胞中观察到的生长缺陷。相反，CUL4B过表达促进肿瘤生长并降低对奥沙利铂的敏感性，而引入miR-143-3p则有效缓解了与CUL4B过表达相关的奥沙利铂耐药。

CUL4B通过泛素化降解FUS抑制miR-143-3p表达

机制上，研究人员发现MLN4924处理和CUL4B敲低均导致Huh7和LM3细胞中FUS蛋白的积累。蛋白质半衰期实验表明，FUS是不稳定的蛋白，蛋白酶体抑制剂MG132处理可导致FUS积累并延长其半衰期。抑制所有CRL活性或单独敲低CUL4B均可延长FUS的半衰期。体内泛素化实验显示，FUS发生多聚泛素化，这一过程被CUL4B敲低所抑制。

FUS在特定miRNAs(包括miR-143-3p)的生物发生中起关键作用，其耗竭会降低miR-143-3p表达水平。实验证实，siRNA敲低FUS显著降低Huh7和LM3细胞中miR-143-3p水平。在CUL4B敲低细胞中沉默FUS，有效阻断了miR-143-3p的上调，表明FUS介导了CUL4B对miR-143-3p的调控。功能上，FUS敲低促进细胞生长，且CUL4B敲低的肿瘤抑制效应被FUS抑制显著减弱。

FUS是CRL4B^DTLE3连接酶的泛素底物

为进一步明确CRL4B复合物的具体组成，研究人员发现敲低DDB1或RBX1均可导致肝癌细胞中FUS积累。通过沉默13个特征明确的受体蛋白，发现DTL敲低显著增加FUS水平并延长其半衰期。免疫共沉淀实验证实了CUL4B-DDB1-RBX1-DTL复合物(CRL4B^DTL)与FUS之间的相互作用。

通过分子对接和分子动力学(MD)模拟，研究人员从结构角度全面阐明了CRL4B^DTL与FUS之间的调控机制。RMSD分析表明CRL4B^DTL-FUS复合物在模拟期间达到平衡并保持稳定构象；RMSF分析显示FUS与CRL4B^DTL相互作用界面核心区域波动极低，表明这些区域保持异常结构稳定性；Rg分析表明FUS在结合时保持一致紧凑的结构。这些结构分析共同证明CRL4B^DTL复合物能够稳定、特异地与FUS相互作用。

CUL4B/FUS/miR-143-3p轴调控KRAS信号

生物信息学分析预测KRAS 3'-UTR存在miR-143-3p结合位点，功能验证证实miR-143-3p直接调控KRAS，其过表达降低而抑制增加KRAS表达。与模型一致，CUL4B敲低降低KRAS表达，而FUS敲低则增加KRAS表达，表明CUL4B/FUS轴通过miR-143-3p反向控制KRAS水平。

下游KRAS效应物分析显示，FUS敲低增加ERK和AKT磷酸化，这一效应可被miR-143-3p过表达逆转。相反，CUL4B敲低降低ERK和AKT磷酸化，但这种抑制被FUS敲低或miR-143-3p抑制所逆转。这些发现证明CUL4B/FUS/miR-143-3p轴至少部分通过激活KRAS信号通路促进HCC生长和奥沙利铂耐药。

研究结论与意义

本研究系统阐明了CUL4B在肝细胞癌中的致癌作用及其作为增强奥沙利铂敏感性靶点的潜力。研究发现异常激活的CUL4B通过促进FUS多聚泛素化和降解，降低miR-143-3p水平，进而激活KRAS信号通路，最终驱动肿瘤进展和化疗耐药。这一新发现的CUL4B/FUS/miR-143-3p/KRAS调控轴不仅深化了对肝细胞癌发病机制的理解，也为开发新的治疗策略提供了重要靶点。

研究的创新性在于首次揭示了FUS作为CRL4B^DTLE3连接酶复合物新型底物的身份，明确了CUL4B通过调控FUS稳定性影响miRNA生物发生的具体机制，并建立了蛋白质泛素化降解与非编码RNA调控之间的直接联系。此外，研究还证实了CUL4B和miR-143-3p作为肝细胞癌独立预后指标的临床价值。

尽管本研究存在一些局限性，如缺乏CRL4B^DTL-FUS复合物的蛋白质结晶结构验证、FUS在不同癌种中调控miR-143-3p表达的普适性有待进一步探索等，但研究结果无疑为肝细胞癌的靶向治疗提供了新的思路。靶向CUL4B可能成为抑制肿瘤生长和恢复奥沙利铂敏感性的有前景策略，为肝细胞癌患者带来新的治疗希望。