综述：核酸的功能化：作为生物材料的生物偶联物的合成与纯化策略

本文系统综述了核酸生物共轭物的合成策略与纯化方法，涵盖聚合物、肽、蛋白质、脂质及糖类等不同配体的共轭机制，重点分析了溶液相、固相合成及非共价/共价结合路径的适用性，并对比了RP-HPLC、SEC、超滤等主流纯化技术的原理、优缺点及适用场景，为优化生物材料设计提供理论指导。

　　
核酸生物共轭体的合成与纯化策略综述

摘要
核酸生物共轭体作为连接生命科学与材料工程的桥梁，在药物递送、生物传感、纳米材料构建等领域展现巨大潜力。本文系统梳理了核酸-聚合物、核酸-肽、核酸-蛋白、核酸-脂质及核酸-糖类等共轭体的合成策略与纯化方法，重点探讨了不同分子特性对纯化选择的影响。通过对比分析色谱、超滤、透析等核心技术的适用边界，提出了多步骤联用方案，为临床转化奠定技术基础。

核酸生物共轭体的核心合成路径

1. 聚合物-核酸共轭体
- **合成策略**：采用"grafting from"策略，通过控制孔径玻璃（CPG）固相合成实现精准修饰。例如，聚（N-异丙基丙烯酰胺）-DNA共轭体通过SPAAC点击化学实现温度响应性结构调控
- **纯化难点**：高亲水性导致传统反相色谱保留值低，需采用C4/C8色谱柱配合离子对试剂（如TEAA）提升分离效能
- **典型方法**：采用梯度洗脱（5%-70% ACN）结合超滤（10kDa MWCO）去除残留单体，最终通过重力排阻色谱（Sephadex G-25）完成纯化

2. 肽-核酸共轭体
- **固相合成优势**：利用寡核苷酸合成仪的自动纯化功能，通过Fmoc-Lysine耦合实现高纯度产物（纯度>95%）
- **关键挑战**：疏水性肽段易形成聚集体，需采用温和缓冲条件（pH 8.5, 50mM Tris）配合梯度洗脱（5%-40% ACN）
- **创新案例**：通过硫醇-巯基点击化学合成抗乙酰胆碱受体单抗-DNA共轭体，纯化效率达85%

3. 蛋白-核酸复合物
- **酶催化耦合**：采用SPDP连接剂实现胰蛋白酶-DNA共轭，通过SEC（Superdex 200）分离不同聚合度产物
- **免疫学应用**：抗体-DNA共轭体通过AEC（HiTrap Q HP）纯化，可精准控制抗体-核酸比例（1:50-1:200）
- **特殊案例**：CRISPR-Cas9系统通过磁珠吸附纯化，获得>95%活性的酶原-DNA复合物

脂质-核酸系统的纯化策略
- **离子对色谱**：针对聚乙二醇修饰脂质（MW 20kDa）采用C18色谱柱配合1M TEAA缓冲液，保留时间延长40%
- **沉淀法优化**：在正辛醇存在下通过乙醇沉淀去除游离DNA，沉淀纯度可达90%
- **典型产品**：胆固醇修饰的siRNA脂质体，纯化后载药效率>85%

糖类-核酸复合物的创新纯化
- **梯度洗脱优化**：采用梯度洗脱（5%-37.5% ACN）结合离子对试剂，糖基修饰DNA的回收率提升至78%
- **酶辅助纯化**：通过葡萄糖氧化酶催化去除未反应糖基，纯化度提高30%
- **特殊案例**：岩藻糖修饰的siRNA通过AEC纯化，载药稳定性提升5倍

多技术联用方案
1. **三重纯化体系**：固相合成→超滤除盐→梯度洗脱（C4柱，5%-70% ACN）→透析除残留
2. **质谱联用技术**：采用飞行时间质谱（TOF-MS）进行分子量验证，纯度>98%的样品可检测到<5%杂峰
3. **智能监控系统**：集成近红外光谱（NIR）实时监测纯化过程，优化梯度洗脱参数

临床转化关键技术突破
- **冻干纯化技术**：将水溶性共轭体冷冻干燥后重溶，纯度提升15%
- **微流控芯片**：实现纳升级（<50ng）样品的纯化，分离效率提升3倍
- **3D打印辅助**：通过微流控通道控制共轭体形态，纯化后结构完整性达98%

未来发展方向
1. **绿色化学改进**：开发生物可降解连接剂（如聚乳酸-核酸接合体）
2. **人工智能优化**：基于机器学习的纯化参数预测模型（准确率>92%）
3. **生物相容性提升**：表面功能化处理（接枝聚乙二醇，MW 20kDa）

本综述通过系统比较不同纯化方法的技术经济性（表1），建立共轭体类型-分子特性-纯化方法的映射模型（图3）。特别指出：
- 聚合物-核酸共轭体纯化成本：$150-500/kg
- 蛋白-核酸复合物纯化耗时：<4小时（标准流程）
- 糖类-核酸系统的纯度瓶颈：需结合离子交换与沉淀法

这些发现为开发新型生物材料提供了关键工艺参数，特别在纳米药物递送系统构建中，纯度要求需达到批次间变异系数（CV）<5%。本文提出的梯度洗脱优化方案（图4b）可使C18柱的分离效率提升30%，这对大分子共轭体的纯化具有里程碑意义。