Caspase 6缺失通过肠上皮细胞坏死性凋亡和细菌易位加剧炎症性肠病

《Cell Death Discovery》：Caspase 6 deficiency exacerbates inflammatory bowel disease via enterocyte necroptosis and bacterial translocation

本研究旨在解决Caspase 6(Casp6)在炎症性肠病(IBD)发病机制中作用不明的问题。研究人员通过构建系统性及肠上皮细胞特异性Casp6基因敲除小鼠模型，结合单细胞RNA测序(scRNA-seq)等技术，发现Casp6缺失会上调RIPK1蛋白表达，激活肠上皮细胞坏死性凋亡通路(RIPK1/RIPK3/MLKL)，并损害巨噬细胞依赖组织蛋白酶L(CTSL)的细菌清除能力，导致细菌易位和肠道炎症加剧。该研究揭示了Casp6在维持肠道稳态中的关键保护作用，为IBD治疗提供了新靶点。

　　

在人体庞大的消化系统中，肠道扮演着至关重要的角色，它不仅负责营养吸收，更是人体最大的免疫器官。然而，一种名为炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease, IBD)的慢性复发性疾病正困扰着全球越来越多的人群。IBD主要包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，其特征是肠道黏膜的持续性炎症和上皮损伤。随着生活方式和环境的改变，IBD的发病率在发展中国家和发达国家都呈现显著上升趋势，给全球带来了沉重的疾病负担。

尽管科学家们对IBD的研究不断深入，但其确切发病机制仍不完全清楚。目前的研究表明，肠上皮屏障功能的破坏在IBD的发生发展中起着关键作用。肠上皮细胞(Intestinal Epithelial Cells, IECs)通过紧密连接形成一道物理屏障，防止肠道内细菌和有害物质进入体内。当肠上皮细胞过度死亡时，这道屏障的完整性就会被破坏，导致肠腔内抗原侵入黏膜下层，引发慢性炎症。

在细胞死亡方式中，除了经典的细胞凋亡(apoptosis)外，坏死性凋亡(necroptosis)作为一种程序性坏死形式，在IBD的炎症进程中日益受到关注。与凋亡不同，坏死性凋亡会导致细胞膜破裂，释放细胞内物质，强烈激活免疫反应，加剧炎症。这一过程主要通过受体相互作用蛋白激酶(Receptor-interacting Protein Kinases, RIPK)信号通路完成，包括RIPK1、RIPK3的激活及其下游效应分子MLKL的磷酸化。

半胱天冬酶(caspase)家族在细胞死亡调控中扮演着重要角色。其中，Caspase 6被归类为效应caspase，已知参与细胞凋亡过程，但它在IBD中的作用却鲜为人知。有趣的是，临床样本分析显示，IBD患者结肠组织中活化的Caspase 6水平显著升高，且与炎症程度呈正相关。这一发现引出了一个关键科学问题：Caspase 6在IBD中究竟是扮演保护角色还是致病角色？

为了回答这个问题，由刘奎杰和郑艳文共同领导的研究团队在《Cell Death Discovery》上发表了他们的最新研究成果。他们通过构建基因敲除小鼠模型，结合先进的单细胞测序技术，深入探究了Caspase 6在IBD发病机制中的具体作用机制。

研究人员采用的主要技术方法包括：从IBD患者和健康对照者获取结肠组织样本进行免疫组化分析；构建全身性Caspase 6基因敲除(Casp6 KO)和肠上皮细胞特异性Caspase 6敲除(Casp6 cKO)小鼠模型，并使用葡聚糖硫酸钠(Dextran Sulfate Sodium, DSS)诱导IBD；运用单细胞RNA测序技术分析结肠组织的细胞组成和基因表达特征；通过体外细胞实验验证Caspase 6对坏死性凋亡通路的影响；采用细菌培养和荧光标记技术评估巨噬细胞的细菌清除能力和体内细菌易位情况。

研究结果

Caspase 6系统性敲除加剧IBD严重程度

研究人员首先在临床样本中发现，IBD患者结肠组织中活化的Caspase 6水平显著高于健康对照组，且与肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α)的表达呈正相关。随后，他们构建了Casp6 KO小鼠，并采用DSS诱导IBD模型。令人意外的是，与预期相反，Casp6 KO小鼠表现出更严重的疾病表型：体重下降更显著、疾病活动指数更高、肠道通透性增加、结肠长度缩短更明显。组织病理学分析显示，基因敲除组小鼠结肠黏膜结构破坏更严重，炎症细胞浸润更广泛，上皮脱落更明显。

单细胞测序揭示Casp6 KO促进肠上皮细胞坏死性凋亡

通过单细胞RNA测序技术，研究人员对WT和Casp6 KO小鼠的结肠组织进行了全面分析，共鉴定出14种不同的细胞类型。对肠上皮细胞的深入分析发现，Casp6 KO导致625个基因表达发生显著变化，其中坏死性凋亡关键基因Ripk1和Ripk3的表达明显上调，而凋亡和自噬相关基因则无显著变化。进一步将肠上皮细胞分为8个亚群后，研究人员发现Casp6 KO显著增加了倾向于发生坏死性凋亡的细胞亚群比例。轨迹分析显示，肠上皮细胞从无坏死性凋亡状态向高表达坏死性凋亡基因的终末状态分化，而Casp6 KO促进了这一过程。免疫荧光分析证实，Casp6 KO小鼠结肠组织中磷酸化RIPK3(p-RIPK3)和磷酸化MLKL(p-MLKL)蛋白水平显著升高，表明坏死性凋亡通路被激活。

肠内分泌细胞和肠道干细胞受损

单细胞测序数据还显示，Casp6 KO导致肠内分泌细胞数量减少，从对照组的6.9%降至4.0%。免疫组化染色发现，基因敲除组肠内分泌细胞标志物嗜铬粒A(Chromogranin A)的表达水平降低。基因表达分析表明，调控肠内分泌细胞分化和功能的关键基因表达发生改变。同时，肠道干细胞数量也从4.6%显著减少至0.8%，干细胞增殖和分化相关标志物表达下降，免疫组化和免疫荧光染色进一步证实了这一发现。

肠上皮细胞特异性Caspase 6敲除同样加剧IBD

为了确认Caspase 6在肠上皮细胞中的特异性作用，研究人员构建了肠上皮细胞特异性Casp6敲除(Casp6 cKO)小鼠。实验结果表明，Casp6 cKO小鼠在DSS诱导后表现出与全身性敲除相似的表型：体重减轻更明显、疾病活动指数更高、肠道通透性增加、结肠缩短更严重。组织学分析显示结肠黏膜完整性破坏更严重，细胞死亡和炎症因子表达水平更高。

Caspase 6缺失通过上调RIPK1蛋白促进坏死性凋亡

体外实验发现，在HT29细胞(一种结直肠腺癌细胞)中，使用Caspase 6特异性抑制剂(Z-VEID-FMK)或小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)敲低Caspase 6表达，都能增强由RIPK1/RIPK3/MLKL激活剂诱导的细胞死亡。Western blotting分析显示，Caspase 6抑制导致p-MLKL和p-RIPK3蛋白水平升高。机制上，Caspase 6干预增加了RIPK1的蛋白水平，但不影响其mRNA表达，且免疫共沉淀实验表明Caspase 6不直接结合RIPK1，提示Caspase 6通过其酶活性调控RIPK1蛋白水平。在体实验也证实，Casp6 KO和cKO小鼠结肠组织中RIPK1表达升高。

Caspase 6敲除损害巨噬细胞细菌清除能力并促进细菌易位

单细胞测序数据显示Caspase 6缺失导致炎症因子IL-1β和TNF-α表达升高。然而，体外实验发现，脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)刺激时，Casp6 KO和WT小鼠的骨髓来源巨噬细胞(Bone Marrow-derived Macrophages, BMDMs)产生的炎症因子无显著差异。当与过氧化氢处理的Caco-2细胞(模拟损伤相关分子模式(Damage-associated Molecular Patterns, DAMPs)共培养时，Casp6 KO巨噬细胞诱导的炎症因子表达反而降低。重要的是，Casp6 KO和cKO小鼠血浆中16S rRNA水平显著升高，结肠组织中干扰素-γ(Interferon-γ, IFN-γ)表达增加，肝脏细菌定植实验显示基因敲除组细菌 colonization 更多，表明细菌清除能力受损且细菌易位增加。

Caspase 6敲除通过组织蛋白酶L依赖的方式降低杀菌活性

进一步机制探讨发现，Caspase 6缺失不影响细菌诱导的细胞凋亡和焦亡(pyroptosis)相关蛋白表达，但显著降低了组织蛋白酶L(Cathepsin L, CTSL)的表达。CTSL是参与病原体降解的关键酶。免疫荧光分析证实，LPS刺激下，Casp6 KO巨噬细胞中CTSL蛋白表达减少。通过腺病毒介导的CTSL过表达，可以恢复Casp6 KO巨噬细胞的杀菌能力，表明Caspase 6通过CTSL依赖的方式调控细菌清除。

研究结论与意义

本研究系统阐明了Caspase 6在IBD中的保护性作用及其分子机制。研究发现，Caspase 6通过酶切RIPK1，抑制肠上皮细胞的坏死性凋亡通路，维持上皮屏障完整性；同时，通过调控CTSL表达，增强巨噬细胞的细菌清除能力，防止细菌易位。当Caspase 6活性缺失时，这两个保护机制同时受损，导致IBD病情加剧。

这一研究不仅揭示了Caspase 6在肠道炎症中的新颖功能，也为IBD治疗策略提供了重要启示。传统的抗凋亡治疗可能因抑制Caspase 6活性而意外触发坏死性凋亡，反而加重疾病。因此，未来的治疗策略应当更加精细地调控细胞死亡方式，在维持适当上皮细胞更新的同时，保护Caspase 6-CTSL介导的抗菌防御体系。该研究为开发针对特定细胞死亡通路的新型IBD治疗方法奠定了理论基础，具有重要的临床转化价值。