基于分裂蛋白高效增强降解技术开发无泄漏化学诱导型Cre重组酶

《Communications Biology》：A chemically inducible, leakless Cre recombinase by split-protein-based efficient and enhanced degradation (SPEED)

本研究针对传统化学诱导DNA重组系统存在背景泄漏的问题，开发了基于分裂蛋白高效增强降解(SPEED)技术的无泄漏化学诱导型Cre重组酶(SPEED-Cre)。研究人员通过将Cre分裂为两个片段并分别标记不稳定结构域(DD)，在无TMP时实现高效降解，而TMP存在时可稳定重组酶活性。实验证明SPEED-Cre在人类细胞和小鼠体内均实现无背景泄漏的完全诱导重组，且该技术可推广至Flp、VCre和Dre等其他重组酶，为活体基因组工程提供了更精准的调控工具。

　　

在基因组工程研究领域，精确控制基因表达的时间和空间特异性一直是科学家们追求的目标。Cre-loxP重组酶系统作为最常用的基因编辑工具之一，可以通过特异性识别loxP位点实现DNA片段的删除、倒位或整合。然而，传统化学诱导型Cre系统如他莫昔芬诱导的Cre-ER存在明显局限性：不仅可能对哺乳动物体内天然靶点产生干扰，更棘手的是在未添加诱导剂时仍会出现背景泄漏活性，这种"漏剪"现象严重影响了实验的精准度。

近年来，基于大肠杆菌二氢叶酸还原酶突变体的不稳定结构域(Destabilizing Domain, DD)系统为这一难题提供了新思路。DD能与抗生素甲氧苄啶(Trimethoprim, TMP)特异性结合，在无TMP时引导融合蛋白快速降解，而添加TMP后则稳定存在。虽然此前开发的DD-Cre系统在一定程度上实现了TMP诱导调控，但研究人员发现，在瞬时转染等高表达情况下，该系统仍存在明显的背景泄漏活性，限制了其在精密基因组编辑中的应用。

为彻底解决这一难题，东京大学的研究团队在《Communications Biology》上发表了一项创新性研究，提出了名为"分裂蛋白高效增强降解(Split-protein-based Efficient and Enhanced Degradation, SPEED)"的新策略。该技术的核心在于将Cre重组酶在152位丝氨酸(Ser¹⁵²)和153位天冬氨酸(Asp¹⁵³)之间分割成两个片段，每个片段分别标记DD结构域，通过巧妙的设计使两个片段在TMP存在时能自我组装成有活性的全酶。

研究人员首先验证了传统DD-Cre系统的局限性。在人类胚胎肾293(HEK293)细胞中，即使将DD-Cre质粒转染量降低400倍，其在无TMP时的背景泄漏活性仍与完整Cre(iCre)相当，且TMP处理无法有效诱导重组活性。这一结果表明单纯依靠DD标记难以实现严格的无泄漏控制。

团队随后开发了自组装分裂Cre(self-assembling split-Cre, sasCre)，发现其重组效率与iCre相当。当在sasCre的两个片段上分别添加DD结构域后，得到的DD-sasCre-DD(即SPEED-Cre)展现出惊人性能：背景泄漏活性比DD-Cre降低960倍，且与阴性对照组无显著差异。更令人印象深刻的是，即使将SPEED-Cre表达量提高10倍，系统仍保持无泄漏特性，而在10 nM TMP处理下即可诱导显著重组活性，500 nM TMP处理48小时后诱导效率达到iCre的83.8%。

Western blot分析从机制上解释了SPEED-Cre的优越性：无TMP时，两个分裂片段浓度极低，无法有效组装；TMP存在时，片段稳定性增加，浓度提升至可组装水平。这种设计确保只有在TMP诱导下才能形成有活性的重组酶。

在活体实验中，研究人员通过小鼠尾静脉高压注射法将SPEED-Cre和报告质粒递送至肝脏。结果显示，DD-Cre在无TMP时仍具有高背景活性，而SPEED-Cre则完全无泄漏，且TMP处理后能诱导完全重组，效率与iCre相当。这一结果证实了SPEED-Cre在复杂生物系统中的实用性。

研究还证明了SPEED策略的普适性。将其应用于Flp、VCre和Dre等其他酪氨酸型位点特异性重组酶时，SPEED-Flp背景泄漏活性极低，而TMP诱导效率高达460倍；SPEED-VCre和SPEED-Dre也展现出类似的严格调控特性，尽管某些情况下诱导效率略低于全长重组酶。

关键技术方法

研究主要采用分子克隆技术构建各种重组酶和报告基因质粒，通过体外细胞实验（荧光素酶报告基因检测、流式细胞术、Western blot）评估重组效率，并利用小鼠尾静脉高压注射模型进行活体验证。关键创新点在于将蛋白质分裂策略与DD降解系统相结合，通过双DD标记实现蛋白质活性的精准调控。

研究结果

DD-Cre的特性分析

通过瞬时转染HEK293细胞实验发现，传统DD-Cre系统在无TMP时存在高背景泄漏活性，与iCre相当，且TMP处理无法有效诱导重组活性。即使大幅降低表达量，泄漏问题依然存在，表明单纯DD标记策略不足以保证严格调控。

SPEED-Cre的开发

将Cre在Ser¹⁵²-Asp¹⁵³位点分割形成的sasCre保持完整酶活性。在此基础上开发的双DD标记SPEED-Cre背景泄漏活性比DD-Cre降低960倍，且TMP诱导效率高达330倍。Western blot证实其调控机制基于片段浓度依赖性组装。

SPEED-Cre的活体表征

小鼠肝脏瞬时表达实验表明，SPEED-Cre在活体中完全无背景泄漏，而TMP处理后能诱导完全重组，效率与iCre相当，验证了其在复杂生物系统中的实用性。

SPEED策略的普适性

将SPEED策略应用于Flp、VCre和Dre重组酶，开发的SPEED-Flp、SPEED-VCre和SPEED-Dre均展现出低背景泄漏和高TMP诱导特性，证明该平台技术的广泛适用性。

结论与讨论

SPEED技术通过将蛋白质分裂与双DD标记相结合，成功解决了化诱导基因编辑系统中的背景泄漏难题。与传统DD-Cre相比，SPEED-Cre在保持高诱导效率的同时实现了真正意义上的无泄漏调控。TMP作为诱导剂具有穿透血脑屏障、快速代谢、低毒性等优势，使该系统特别适合活体应用。虽然某些重组酶的SPEED版本诱导效率略低，但这种特性反而有利于稀疏标记等需要精细调控的应用场景。该技术还可通过使用异源二聚化结构域扩展至非自组装分裂蛋白，结合计算生物学预测的分割位点，有望成为蛋白质功能精准调控的通用平台。这项研究为基因组工程提供了更精确、可靠的化学遗传学工具，将推动发育生物学、神经科学和基因治疗等领域的发展。