活菌细胞内ProQ-mRNA相互作用的结构依赖性研究

《Communications Biology》：Structural dependence of ProQ-mRNA interactions in live bacterial cells

为解决细菌RNA结合蛋白ProQ如何调控基因表达这一关键问题，研究人员通过单分子追踪技术，系统探究了ProQ结构域对其在活菌细胞内结合mRNA功能的影响。研究发现，ProQ主要通过其C端结构域和连接区与mRNA结合，且不同mRNA对ProQ N端结构域残基的依赖性各异，揭示了ProQ调控的复杂性和特异性，为理解细菌应激反应机制提供了新视角。

　　

在微观的细菌世界里，生存是一场永不停歇的战斗。面对抗生素的威胁、宿主免疫系统的攻击以及营养匮乏等恶劣环境，细菌进化出了一套精密的基因表达调控系统来迅速适应变化。在这场生存竞赛中，RNA结合蛋白（RBP）扮演着至关重要的角色，它们如同分子指挥官，通过调控信使RNA（mRNA）的稳定性和翻译效率，快速改变细胞的蛋白质组构成。过去几十年，科学家们对一种名为Hfq的全局性RBP进行了深入研究，它作为小调控RNA（sRNA）的“红娘”，帮助sRNA与靶标mRNA配对，从而在细菌应激响应中发挥核心作用。

然而，细菌的基因调控网络远比我们想象的复杂。近年来，另一个名为ProQ的全局性RBP逐渐进入科学家的视野。与Hfq类似，ProQ也被发现能够与大量的mRNA和sRNA相互作用。但ProQ的RNA结合谱与Hfq有很大不同，暗示着它们可能扮演着不同的角色。更引人入胜的是，初步研究表明ProQ可能更倾向于识别RNA的二级结构而非特定序列，这为其功能机制披上了一层神秘的面纱。ProQ蛋白本身由三个主要部分构成：N端的FinO结构域（NTD）、一个带正电荷的柔性连接区，以及C端的Tudor结构域（CTD）。体外实验提示，NTD可能是ProQ结合sRNA的主要区域，但其在活体细胞内如何与全长mRNA相互作用，各个结构域又分别贡献了什么功能，这些关键问题仍然悬而未决。理解ProQ的工作机制，对于阐明细菌在生物膜形成、致病性和环境适应等方面的内在规律具有重大意义。

为了回答这些问题，由Jingyi Fei和Eric Massé领导的研究团队在《Communications Biology》上发表了他们的最新研究成果。他们巧妙地运用了单分子追踪（SMT）这一尖端技术，如同给ProQ蛋白装上了“微型追踪器”，在活生生的大肠杆菌细胞内实时观察其运动轨迹。通过分析ProQ在不同生长条件（指数期、稳定期）和应激条件（渗透胁迫）下的扩散行为，并结合一系列精巧的ProQ结构域缺失和点突变体，研究人员首次在活细胞水平系统揭示了ProQ与mRNA相互作用的结构基础及其动态特性。

为开展本研究，作者主要应用了以下关键技术：首先，利用基因工程手段构建了C端标记有光激活荧光蛋白PAmCherry的ProQ菌株以及一系列结构域缺失和点突变体，并验证了其功能正常性。其次，核心实验技术为活菌单分子追踪显微镜技术，通过高速成像（120帧/秒）和轨迹分析，获取ProQ蛋白的扩散系数。第三，通过使用转录抑制剂利福平（RIF）处理来耗尽细胞内mRNA，以区分ProQ的mRNA结合与非结合状态。第四，利用细菌三杂交和Northern blot等技术验证了sRNA的表达和结合特异性。第五，采用累积概率密度函数拟合和贝叶斯非参数建模（saSPT）两种方法对扩散轨迹进行群体分析，量化不同状态的ProQ分子比例。所有菌株均使用大肠杆菌模型。

ProQ在指数生长期展示出全局mRNA结合能力

研究人员首先在正常生长（无处理，NT）条件下追踪了野生型（WT）ProQ的运动。他们发现，大部分（约68%）的ProQ分子处于慢扩散状态，其扩散系数（D_slow）远低于自由扩散的蛋白。当用RIF处理细胞以耗尽mRNA后，慢扩散的ProQ群体显著减少，而快扩散群体（D_fast）相应增加。这表明在指数生长期，ProQ主要与细胞内的mRNA相结合。通过两种独立的分析方法（CDF拟合和saSPT）得出的结论高度一致。

ProQ在稳定期仍与mRNA结合但其丰度降低

当细胞进入稳定期，ProQ的扩散系数及其mRNA结合比例与指数期相比没有显著变化。然而，通过计算单分子定位点数目发现，ProQ在稳定期的蛋白丰度急剧下降至指数期的约10%。这表明，尽管结合特性不变，但细胞在稳定期下调了ProQ的表达水平，可能以适应整体基因表达谱的变化。

渗透胁迫下ProQ呈现超慢扩散状态

在渗透胁迫（高盐）条件下，一个有趣的现象出现了。saSPT分析揭示了ProQ存在四种扩散状态，除了与指数期类似的快扩散（D_fast）和慢扩散（D_slow，但其速度略有增加）状态外，还出现了两个“超慢”扩散状态（D_ultra-slow,1和D_ultra-slow,2）。研究人员推测，D_slow的轻微加快可能与渗透胁迫下翻译活动全局减弱、mRNA-核糖体复合物变小有关。而超慢状态的形成可能源于ProQ与更大的分子复合物结合、在空间受限区域运动，甚至可能形成了类似生物分子冷凝物的结构，这为后续研究提供了新的方向。

Hfq的缺失对ProQ-mRNA相互作用影响甚微

尽管Hfq和ProQ有部分重叠的RNA结合靶标，但在缺失Hfq（Δhfq）的菌株中，ProQ的扩散行为与野生型背景相比没有显著差异。这说明要么共享的mRNA靶标在ProQ的总相互作用组中占比不大，要么ProQ和Hfq倾向于结合同一mRNA分子的不同区域，互不干扰。这支持了二者具有不同RNA结合偏好的观点。

ProQ的链接区和CTD对其体内mRNA结合能力有重要贡献

这是本研究的核心发现之一。研究人员构建了仅包含NTD（ProQ NTD）或包含NTD及链接区（ProQ NTD+linker）的截短突变体。SMT结果显示，与全长ProQ相比，这些截短体的mRNA结合能力大幅削弱。ProQ NTD几乎完全丧失了结合mRNA的能力，而ProQ NTD+linker的mRNA结合比例也下降了约50%。这表明，对于全长mRNA底物的有效结合，ProQ的链接区和CTD是必不可少的，这与之前关于某些sRNA仅靠NTD即可结合的观点形成了鲜明对比。

ProQ的mRNA结合活性对NTD残基表现出差异性依赖

为了探究NTD中特定残基的作用，研究人员测试了多个点突变体（K54A, R58A, Y70S, D82A）。结果发现，这些残基对全局mRNA结合的影响程度各异。Y70S突变几乎完全废除了ProQ的mRNA结合能力，说明酪氨酸70（Y70）是一个普遍关键残基。R58A突变导致中度下降，而K54A和D82A突变的影响则很小。这表明，虽然Y70对结合大多数mRNA都至关重要，但其他残基的作用则因mRNA底物的不同而异，反映了ProQ-mRNA相互作用的复杂性。

ProQ的CTD和链接区有助于sRNA的竞争性结合

最后，研究人员探究了sRNA是否能像在Hfq案例中那样竞争性结合ProQ。他们诱导表达了三种已知的ProQ结合sRNA（cspE 3‘UTR、STnc1690和SibC），并观察它们对ProQ扩散的影响。结果发现，这些sRNA只能轻微地（约2-20%）将mRNA从全长ProQ上置换下来。这种较低的竞争效率可能与ProQ的细胞内丰度（约17000拷贝/细胞）远高于诱导表达的sRNA（270-950拷贝/细胞）有关。更重要的是，当ProQ缺失CTD或链接区后，cspE 3‘UTR和SibC竞争mRNA结合位点的能力也随之丧失，而STnc1690的竞争能力受影响较小。这说明sRNA竞争mRNA结合位点的能力也依赖于ProQ的CTD和链接区，进一步强调了这些结构域在ProQ动态RNA交换过程中的重要作用。

本研究通过先进的活细胞单分子成像技术，清晰地描绘了ProQ作为细菌全局RNA结合蛋白的工作画像。结论表明，与Hfq类似，ProQ在指数生长期主要与mRNA结合，但其结构依赖性更为复杂。不同于其与某些sRNA的相互作用，ProQ与全长mRNA的有效结合严重依赖于其C端结构域（CTD）和链接区。同时，其N端结构域（NTD）中的关键残基（如Y70）对mRNA结合至关重要，而其他残基的作用则表现出底物特异性。此外，ProQ在渗透胁迫下表现出独特的超慢扩散状态，暗示了其在应激条件下可能参与更复杂的分子组装。

这些发现的重要意义在于，它们超越了传统的体外生化实验的局限，直接在活体细菌细胞内揭示了ProQ的功能机制，强调了蛋白质结构域在复杂细胞环境中的功能语境依赖性。研究不仅证实了ProQ是一个重要的mRNA结合蛋白，还阐明了其与sRNA不同的结合模式，为理解细菌中并存的多种全局调控网络提供了新的框架。对ProQ结构-功能关系的深入理解，有望为未来开发针对细菌致病性或环境适应性的新型干预策略提供潜在的分子靶点。