颅缝早闭新机制：p38α MAPK诱导的颅缝祖细胞衰老促进颅骨融合

《Communications Biology》：P38α MAPK-induced senescence in cranial suture progenitor cells promotes craniosynostosis

本研究针对颅缝早闭中祖细胞异常机制不清的难题，聚焦p38α MAPK信号通路，发现其过度激活诱导颅缝祖细胞(SPC)衰老，并通过分泌Tgf-β1促进邻近细胞成骨分化，最终导致颅缝过早融合。通过药理学抑制、基因敲除及scAAV-shRNA干预，证实靶向p38α MAPK能有效缓解小鼠模型颅缝融合及颅面畸形，为颅缝早闭治疗提供了新靶点。

　　

颅骨并非一块完整的骨头，而是由几块骨板通过纤维连接——颅缝拼接而成。这些颅缝在婴幼儿时期保持开放状态，为大脑的快速生长提供了必要的空间。然而，当一条或多条颅缝过早融合，就会导致一种名为颅缝早闭（Craniosynostosis）的先天性颅面发育畸形。这种疾病的发病率约为1/2500，不仅会引起头颅外观异常，更严重的是可能因为颅腔容积受限而压迫大脑，导致颅内高压、脑积水，甚至智力发育障碍，对患儿及其家庭造成沉重负担。

在众多导致颅缝早闭的基因突变中，成纤维细胞生长因子受体（Fibroblast Growth Factor Receptor, FGFR）家族基因的突变最为常见，其中FGFR2基因突变与多种综合征型颅缝早闭相关，如最常见的Crouzon综合征。颅缝不仅仅是骨缝，它更是一个特殊的微环境，是颅缝祖细胞（Suture Progenitor Cells, SPC）的栖息地。这些祖细胞具有自我更新和多向分化潜能，对于维持颅缝的开放以及颅骨的生长和修复至关重要。此前研究已明确SPC的功能异常是颅缝早闭发生的关键环节，然而，驱动SPC发生异常改变的具体分子机制仍不清楚，这严重制约了针对性的治疗策略的开发。

发表在《Communications Biology》上的这项研究，正是为了揭开这一谜团。研究人员利用基因编辑技术成功构建了模拟人类Crouzon综合征的Fgfr2^C361Y/+小鼠模型，发现这些突变小鼠在出生后早期就出现了冠状缝间充质细胞的急剧减少和颅缝的过早融合。深入探究发现，这与细胞衰老（Cellular Senescence）密切相关。与野生型小鼠相比，突变小鼠冠状缝组织中衰老相关蛋白p53和p21的表达显著升高，衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色阳性细胞增多，而细胞增殖活性则明显下降。尤为关键的是，研究人员通过流式细胞术分离并鉴定了SPC（CD51⁺CD200⁺CD105^-），发现突变小鼠来源的SPC出现了明显的G1/G0期细胞周期阻滞、DNA损伤增加以及衰老表型。

那么，是什么触发了SPC的衰老呢？通过siRNA亚库筛选和后续验证，研究团队将目标锁定在了p38α丝裂原活化蛋白激酶（p38α MAPK，由Mapk14基因编码）上。他们发现，在Crouzon小鼠模型中，p38α MAPK在出生后出现异常的高度活化，进而激活了下游的p53/p21信号通路，最终诱导了SPC的衰老。这种p38/p53通路的激活和细胞衰老现象并非Crouzon模型所独有。研究人员对来自公共数据库的人类非综合征性颅缝早闭患者组织、诱导多能干细胞（iPSC）来源的间充质干细胞、Apert综合征（Fgfr2^+/S252W）以及Saethre-Chotzen综合征（Twist1^+/-）小鼠模型的颅缝组织RNA测序数据进行了整合分析，结果表明p38 MAPK激活、p53通路激活以及细胞衰老相关的基因集在这些不同类型的颅缝早闭样本中均显著富集。他们还在细胞水平上通过慢病毒转染模拟Fgfr2突变或Twist1单倍体不足，进一步验证了这两种情况均能导致p38 MAPK和p53的激活，并促进细胞衰老。

衰老细胞的一个重要特征是分泌一系列炎性因子、生长因子和蛋白酶等，统称为衰老相关分泌表型（Senescence-Associated Secretory Phenotype, SASP）。本研究发现在衰老的SPC中，多种SASP因子（如Tgf-β1, Vegfa, Cxcl12）的mRNA水平显著上调，其中Tgf-β1的蛋白分泌水平增加了约5倍。通过构建共培养体系，研究人员发现衰老的SPC（来自突变小鼠）能够通过旁分泌作用，显著增强邻近正常SPC的成骨分化能力，而这一效应主要由Tgf-β1介导，因为使用Tgf-β1受体抑制剂（SB525334）可以有效地挽救这种促分化作用。

基于上述机制发现，研究团队从三个层面进行了干预研究，以验证靶向p38α MAPK的治疗潜力。在药理学层面，局部皮下注射p38 MAPK抑制剂（SB203580）或p53抑制剂（Pifithrin-α）能够减轻SPC的衰老，并在离体颅盖培养模型和小鼠体内实验中，不同程度地缓解了冠状缝的融合。在遗传学层面，研究人员构建了在Prrx1阳性细胞（SPC的主要群体）中条件性敲除Mapk14的小鼠模型（Fgfr2^C361Y/+;Prrx1^cre/+;Mapk14^f/f）。结果显示，特异性敲除SPC中的p38α MAPK能够有效防止SPC衰老，显著改善颅缝早闭和颅面畸形。最后，为了探索更具转化前景的干预策略，他们使用了自我互补型腺相关病毒（scAAV9）装载靶向Mapk14的短发夹RNA（shRNA），通过新生儿头皮皮下注射进行基因减量治疗。这种scAAV-shMapk14疗法不仅显著缓解了突变小鼠的颅缝融合和颅骨畸形，还降低了其异常升高的颅内压，并改善了其在旋转棒实验和新物体识别测试中的行为学表现。

为开展此项研究，作者团队运用了多项关键技术：利用CRISPR/Cas9技术构建了Fgfr2^C361Y/+Crouzon综合征小鼠模型；通过流式细胞术分选和功能验证了颅缝祖细胞(SPC)；采用siRNA亚库筛选结合双荧光素酶报告基因实验鉴定上游调控因子；利用免疫荧光、Western blotting、SA-β-Gal染色等多种细胞分子生物学技术进行表型验证；构建了细胞共培养模型以研究旁分泌效应；进行了离体颅盖培养；运用了条件性基因敲除(Mapk14^f/f; Prrx1^cre/+)和scAAV-shRNA介导的基因减量治疗等遗传干预手段；并通过微型计算机断层扫描(μCT)、颅内压监测和行为学测试评估干预效果。此外，研究还整合分析了来自公共数据库(GEO, Facebase)的人类患者和小鼠模型的RNA测序数据。

Crouzon小鼠表现出出生后早期冠状缝结构紊乱、细胞衰老和间充质成分耗竭

研究人员发现，Fgfr2^C361Y/+小鼠（MUT）出现了与人类Crouzon综合征相似的面部缩短、短头畸形、眼球突出等症状。组织学分析显示，与野生型（WT）小鼠相比，MUT小鼠在出生后早期（P7）冠状缝的间充质细胞就急剧减少，缝线结构紊乱，并出现骨小梁连接，至P14-P28时完全闭合。而衰老标志物p53、p21蛋白表达在MUT小鼠冠状缝组织中升高，RNA测序和基因集富集分析（GSEA）进一步证实细胞衰老和p53通路相关基因集在MUT组中显著上调。免疫染色显示MUT小鼠冠状缝区域p21阳性细胞显著增加，SA-β-Gal阳性细胞增多，Ki-67阳性增殖细胞减少，但细胞凋亡指标（cleaved caspase-3）无显著差异，表明间充质成分的耗竭主要归因于细胞衰老而非凋亡。

Prrx1⁺SPC在MUT小鼠冠状缝中表现出衰老增加和成骨分化增强

通过流式细胞术，研究发现MUT小鼠冠状缝中SPC（CD51⁺CD200⁺CD105^-）的比例在出生后早期（P1-P10）就呈现进行性下降。分选出的MUT SPC表现出G1/G0期细胞周期阻滞、SA-β-Gal阳性率增高和DNA损伤（彗星实验尾DNA百分比增加）等衰老特征。同时，MUT SPC的碱性磷酸酶（ALP）活性增强，免疫染色显示MUT小鼠冠状缝早期（P1-P7）成骨分化标志物ALP和骨钙素（Ocn）表达上调。进一步的免疫荧光染色表明，MUT小鼠中的衰老细胞主要是Prrx1⁺细胞，部分Ctsk⁺细胞也呈现衰老，提示Prrx1⁺和/或Ctsk⁺SPC的衰老是缝线间充质耗竭的主要原因。

p38α MAPK过度活化介导的p53激活诱导了MUT小鼠SPC的表型改变

通过针对p53激活/调控相关基因的siRNA亚库筛选，发现敲低Mapk14（编码p38α MAPK）能最有效地降低SPC中p53的激活水平。Western blot验证证实敲低Mapk14可显著降低MUT SPC中的p53水平。免疫染色显示，在MUT小鼠中，p38α MAPK的磷酸化激活（p-p38）在出生后显著增强，并与p53激活密切相关。GSEA也显示p38 MAPK激活相关基因集在MUT小鼠中上调。此外，敲低Mapk11（p38β）或抑制Erk1/2并不影响p53/p21通路的激活，表明p38α亚型在介导SPC衰老中起主导作用。

抑制p38α MAPK可挽救并阻止MUT SPC衰老，同时抑制SPC成骨分化

使用p38 MAPK抑制剂（SB203580）和p53抑制剂（Pifithrin-α）处理MUT SPC（来自P1小鼠），结果显示这两种抑制剂都能减轻G0/G1期细胞周期阻滞，促进Rb磷酸化，增加细胞增殖（EdU阳性细胞），降低p53/p21蛋白水平，减少SA-β-Gal阳性细胞数量，并抑制SPC的成骨分化（ALP染色）。然而，对于来自P7 MUT小鼠的SPC，抑制剂处理并不能显著减少衰老细胞比例，表明SPC的衰老表型仅在早期阶段是可逆和可挽救的。

p38/p53激活和细胞衰老在人类颅缝早闭患者和小鼠模型的颅缝间充质中普遍存在

对公共数据库中的RNA测序数据进行分析发现，与对照组相比，来自人类非综合征性颅缝早闭的融合缝线组织、SNORD118缺陷iPSC来源的MSC、颅缝早闭患者颅骨成骨细胞、Apert综合征和Saethre-Chotzen综合征小鼠模型的冠状缝间充质组织中，p38 MAPK激活、p53激活、细胞衰老以及新型衰老标志基因集"Senmayo"均显著富集。通过慢病毒转染MC3T3-E1细胞模拟Fgfr2突变或Twist1单倍体不足，实验证实这两种干预均能升高p-p38蛋白水平、增加p53阳性细胞比例并促进细胞衰老。

衰老细胞分泌的Tgf-β1可显著刺激邻近SPC的成骨分化

研究发现MUT SPC中多种SASP因子mRNA水平上调，其中Tgf-β1的分泌水平显著增加（约5倍），且可被p38α MAPK/p53抑制剂抑制。共培养实验表明，衰老的MUT SPC能通过旁分泌作用显著增强共培养的WT SPC的成骨分化水平（共培养5或7天后ALP染色增强），但直到第7天才诱导WT SPC出现衰老变化。使用梯度浓度Tgf-β1蛋白处理WT SPC，证实1 ng/mL和5 ng/mL Tgf-β1处理5天即可显著增强其成骨分化。在共培养体系中，p38 MAPK抑制剂（SB203580）和Tgf-β1抑制剂（SB525334）均能挽救衰老细胞SASP对SPC成骨分化的促进作用。

药理学、基因减量或条件性敲除p38α MAPK可减轻Crouzon小鼠的颅缝早闭和颅面畸形

在离体颅盖培养模型中，p38 MAPK抑制剂、p53抑制剂和Tgf-β1抑制剂均能不同程度地缓解MUT小鼠冠状缝的融合，并恢复SPC的数量。通过皮下注射这些抑制剂给新生小鼠，也观察到了类似的缓解缝线融合的效果。为了克服药物脱靶效应等问题，研究人员构建了Mapk14条件性敲除小鼠。结果显示，在Prrx1阳性细胞中完全敲除Mapk14（Mapk14^f/fcKO）能有效维持颅缝开放，改善颅面畸形，挽救SPC衰老，并部分抑制其成骨潜能。最后，采用scAAV9-shRNA_Mapk14皮下注射进行基因减量治疗，成功地在体内抑制了p38α MAPK的过度激活。这种疗法显著改善了突变小鼠的颅骨畸形，防止了缝线融合，降低了异常升高的颅内压，并改善了其在旋转棒实验（潜伏期延长）和新物体识别测试（对新物体的偏好指数提高）中的行为表现。

本研究深入揭示了p38α MAPK信号通路在颅缝早闭发病机制中的核心作用。该通路通过诱导颅缝祖细胞（SPC）衰老，并促使衰老细胞分泌Tgf-β1，以旁分泌方式增强邻近SPC的成骨分化，共同导致颅缝间充质耗竭和过早骨性融合。重要的是，这种p38/p53通路激活和细胞衰老的表型在多种人类和小鼠模型的颅缝早闭中普遍存在，提示这可能是一种共通的病理机制。研究的创新性不仅在于机制探索，更在于通过多层次干预（药理学抑制、条件性基因敲除、scAAV-shRNA基因治疗）证实了靶向p38α MAPK对于缓解颅缝早闭的潜在治疗价值。然而，研究也指出p38 MAPK在生理性骨形成中同样不可或缺，完全且持续地抑制该通路可能会影响正常的骨骼发育。因此，未来治疗策略需要考虑精准的干预时间窗和给药方式，以平衡治疗效果与潜在副作用。这项由Zong Chen、Zhiyou Chen、Xiaolei Jin等作者完成的研究，为理解颅缝早闭的细胞分子机制提供了新视角，并为开发针对这一先天性颅面畸形的靶向治疗策略奠定了坚实的理论基础。