GM1神经节苷脂通过抑制初级成核延缓Aβ(1-42)聚集的机制及其受鞘磷脂和胆固醇的调控

《Communications Chemistry》：Ganglioside GM1 slows down Aβ(1-42) aggregation by a primary nucleation inhibitory mechanism that is modulated by sphingomyelin and cholesterol

本研究针对阿尔茨海默病中淀粉样蛋白-β（Aβ）聚集受脂质调控但机制不清的问题，通过动力学分析揭示了GM1神经节苷脂通过隔离可溶性Aβ(1-42)并抑制初级成核而延缓纤维形成，且该抑制作用在胆固醇（Chol）和鞘磷脂（SM）存在的筏状膜域中被显著增强，阐明了膜脂组成与物理性质在调控Aβ聚集中的协同作用，为理解脂质稳态失调在神经退行性疾病中的作用提供了新视角。

　　

在阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）复杂而尚不完全清晰的病理图景中，淀粉样蛋白-β（Amyloid-β, Aβ）肽从可溶性单体转化为不溶性的淀粉样纤维沉积是一个核心事件。尽管针对Aβ聚集的治疗策略已取得一些进展，例如靶向聚集形式Aβ的抗体的临床批准，但深刻理解其聚集过程以及内外因素如何调控这一过程，对于开发更有效的疗法至关重要。大脑是一个脂质极其丰富的器官，脂质稳态的破坏和膜脂组成的改变是AD中常见的病理发现，也与衰老密切相关。Aβ肽在其产生和存在的许多膜丰富区域（如神经元突触、线粒体、高尔基体网络等）都不可避免地与脂膜发生相互作用。事实上，脂质普遍存在于Aβ斑块中，暗示它们在Aβ相关病理中扮演着重要的调控角色。体外生物物理研究已经表明，合成脂质体以及细胞来源的细胞外囊泡能够深刻改变Aβ纤维化的速率和机制。然而，报道的效果多种多样，甚至相互矛盾，例如某些磷脂能催化聚集，而模仿高尔基体和内质网组成的囊泡则显示出抑制作用。这提示我们，不仅是特定脂质的化学性质，它们在脂双层中的相互作用和组织方式也至关重要。尤其是脑内富含的唾液酸化糖鞘脂——神经节苷脂（Gangliosides, GMs），特别是GM1（Monosialotetrahexosylganglioside GM1），因其与Aβ的相互作用以及与AD病理的关联而受到广泛关注。但文献中关于GM1对Aβ聚集的影响存在争议，既有报道其抑制聚集，也有报道其加速寡聚体和纤维形成，表明GM1可能是一个情境依赖性的调控因子。因此，在更接近生物膜复杂性的模型中，系统研究GM1与其他关键脂质（如同样与AD病理相关且共同参与脂筏形成的胆固醇和鞘磷脂）的协同或竞争效应，对于阐明生物膜在Aβ聚集病理中的确切作用机制具有迫切必要性。

为了回答上述问题，研究人员主要运用了几项关键技术：利用硫黄素T（Thioflavin-T, ThT）荧光监测的蛋白质聚集动力学分析，结合数学模型拟合，以确定脂质膜对Aβ_(1-42)聚集途径中不同反应步骤（如初级成核、二级成核）速率的影响；制备了20种不同脂质组成（系统性变化GM1、胆固醇、鞘磷脂在DMPC基质中的比例）的大单层脂质体（Large Unilamellar Vesicles, LUVs）作为模型膜；利用劳丹（Laurdan）荧光测定法评估模型膜的相对流动性（膜序参数）；通过原子力显微镜（Atomic Force Microscopy, AFM）观察终点聚集样品的形貌；利用圆二色光谱（Circular Dichroism, CD）探测Aβ_(1-42)单体与脂质膜相互作用诱导的二级结构变化；并通过细胞活力实验（人SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞，使用Alamar Blue法）评估不同条件下形成的Aβ聚集体的毒性。所有Aβ_(1-42)单体在实验前均通过尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography, SEC）进行纯化以确保起始状态。

结果

脂质囊泡根据其膜组成不同地调节Aβ_(1-42)聚集速率

研究人员制备了20种脂质组成不同的LUVs，系统性地改变GM1、鞘磷脂（Sphingomyelin, SM）和胆固醇（Cholesterol, Chol）在DMPC基质中的含量。首先通过劳丹实验确认了这些模型膜具有从液态无序到液态有序的不同流动性。ThT聚集动力学实验表明，这些LUVs对Aβ_(1-42)（2 μM）的纤维形成速率产生了显著且多样的影响，包括催化和延迟，具体取决于LUV的组成。原子力显微镜确认所有条件下最终都形成了淀粉样纤维，且纤维宏观形态相似，表明LUVs主要影响聚集动力学而非最终产物形态。

GM1、胆固醇和SM脂质调节Aβ_(1-42)纤维组装途径中的不同反应步骤

对动力学曲线的形状参数（半时间、滞后时间、生长时间）进行分析发现，滞后时间的变化与半时间的变化高度相关，表明脂质膜引起的动力学改变主要源于对初级成核速率的影响。生长时间的变化则与脂质类型关系不大，提示膜表面可能对纤维延伸或二级过程有较通用的催化作用。进一步通过动力学模型拟合发现，大多数LUVs（尤其是含GM1和Chol的）对动力学的改变最好通过初级成核复合速率常数（k₊k_n）的变化来解释，而一些含SM的LUVs则更符合二级成核复合速率常数（k₊k₂）的变化。

GM1减少初级成核，隔离可溶性Aβ_(1-42)并消除纤维毒性

对GM1的深入研究显示，含GM1的LUVs（DMPC:GM1）显著延迟了Aβ_(1-42)的聚集，且其动力学曲线出现双峰滞后相，提示存在两个并行的抑制过程。种子实验表明，加入预形成的Aβ_(1-42)纤维种子后，GM1 LUVs的抑制作用消失，证明GM1是初级成核的动力学抑制剂。圆二色光谱显示GM1与Aβ_(1-42)单体相互作用并诱导了β-折叠结构的形成，表明膜结合的GM1能够隔离可溶性Aβ。细胞毒性实验进一步证实，在GM1存在下形成的Aβ聚集体对神经细胞的毒性显著降低，支持了GM1可能具有保护作用的观点。

胆固醇和鞘磷脂通过不同机制加速Aβ_(1-42)聚集

与GM1相反，胆固醇和SM在二元组成的LUVs中均表现出催化效应。动力学模型拟合和种子实验表明，胆固醇主要通过加速初级成核来催化聚集，这可能与其小羟基头基增加膜界面间距和流动性，从而促进Aβ结合有关，圆二色光谱也观察到了相互作用的迹象。而SM则主要通过增强二级成核来催化聚集。

在具有混合脂质组成的LUVs中，Aβ_(1-42)聚集的延迟和催化之间出现竞争

当将具有相反内在效应（GM1抑制 vs. Chol/SM催化）的脂质混合在同一膜中时，出现了不同的趋势。在DMPC:SM:GM1 LUVs中，SM的催化效应完全主导，甚至比单纯的DMPC:SM LUVs催化更强，表明GM1可能增强了SM介导的催化而非竞争。而在DMPC:Chol:GM1 LUVs中，则观察到直接的竞争，结果取决于总脂浓度（即肽脂比）：在低脂浓度下Chol的催化占主导，在高脂浓度和高GM1比例下GM1的延迟占主导。这表明两种相反效应的脂质混合时，其净效应并非简单加和，而是取决于具体的作用机制和条件。

膜刚性增强GM1介导的Aβ_(1-42)聚集延迟并胜过其他脂质的催化效应

最后，研究人员考察了模拟脂筏组成的四元（DMPC:SM:Chol:GM1）LUVs。这些具有低流动性的LUVs对Aβ_(1-42)聚集表现出强烈的抑制作用，这源于滞后时间的延长和初级成核速率的降低，表明GM1的抑制机制被显著增强。相关性分析显示，反应半时间和滞后时间与膜刚性（劳丹GP值）呈正相关，而生长时间则与膜流动性无关。这表明，在形成刚性更强的脂筏样结构时，胆固醇和SM似乎“放弃”了其固有的催化作用，转而促进GM1的聚集抑制功能，突出了膜物理性质（如刚性）在调控蛋白聚集中的重要性。

结论与讨论

本研究通过系统的动力学分析和机制建模，阐明了GM1、胆固醇和鞘磷脂这三种与AD高度相关的脂质在调控Aβ_(1-42)聚集中的作用机制及其协同/竞争关系。研究证实，GM1通过隔离可溶性Aβ并抑制初级成核而延缓纤维形成，且形成的聚集体毒性较低；胆固醇主要通过促进初级成核来催化聚集；而鞘磷脂则主要增强二级成核。更重要的是，研究揭示了在复杂的混合脂质膜中，脂质间的相互作用并非其固有效应的简单加和。当脂质混合形成流动性较高的膜时，可能发生竞争（如GM1与Chol）或某一效应占主导（如SM压倒GM1）。然而，当这些脂质共同形成刚性较高的脂筏样膜域时，膜的物理性质（低流动性）会显著增强GM1的抑制效应，甚至使原本具有催化作用的Chol和SM转而支持这一抑制过程。这强调了脂质环境（如膜的流动性和横向组织）对脂质介导的蛋白聚集调控的最终结果具有决定性影响。

这项研究概念上扩展了当前关于生物膜如何调控蛋白质聚集的分子和机制理解。它表明，细胞凭借其膜的复杂性，能够对淀粉样蛋白的溶解性和聚集进行精细调控。而在衰老或疾病过程中，脂质稳态的破坏可能会抵消这种控制，从而驱动病理性聚集体的形成。对于阿尔茨海默病而言，研究结果为进一步理解脑脂质变化如何影响Aβ病理提供了重要的机制性见解，特别是为调和关于GM1等脂质在AD中看似矛盾的作用提供了新的视角。该论文发表于《Communications Chemistry》。