FUT3介导GRP78岩藻糖基化通过PERK/ATF4/STC2轴促进结直肠癌在葡萄糖限制下的生存与增殖

《npj Precision Oncology》：FUT3 mediated GRP78 fucosylation promotes colorectal cancer survival and proliferation under glucose restriction via PERK/ATF4/STC2 axis

本研究针对肿瘤微环境中葡萄糖剥夺如何通过糖基化修饰调控内质网应激的关键科学问题，研究人员聚焦FUT3介导的GRP78岩藻糖基化修饰主题，发现该修饰通过激活PERK/ATF4/STC2信号轴，显著增强结直肠癌在营养胁迫下的适应能力。这项研究揭示了糖代谢与蛋白质翻译后修饰交叉调控的新机制，为靶向肿瘤代谢微环境提供了新型治疗策略。

　　

在肿瘤微环境这个复杂的生态系统中，营养物质的激烈竞争构成了癌细胞生存的核心挑战。结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）作为全球最常见且致死率较高的恶性肿瘤之一，其发生发展与微环境中的代谢重编程密切相关。传统观点认为高葡萄糖环境促进肿瘤进展，但近年研究发现，实体肿瘤内部常存在血管分布不均导致的营养匮乏区域，癌细胞需要发展出独特的适应机制来应对葡萄糖限制（Glucose Restriction）的压力。在这种代谢压力下，癌细胞如何通过分子层面的精巧调控实现生存和增殖，成为肿瘤生物学领域亟待阐明的重要科学问题。

糖基化修饰，特别是岩藻糖基化（Fucosylation），作为蛋白质重要的翻译后修饰方式，在肿瘤进展中扮演着关键角色。岩藻糖基转移酶（FUTs）家族负责催化岩藻糖基转移到糖蛋白或糖脂上，其中FUT3（岩藻糖基转移酶3）在多种癌症中表达异常，与肿瘤恶性表型相关。然而，在葡萄糖限制的微环境下，FUT3如何调控结直肠癌的适应性反应，其具体分子机制尚不明确。

另一方面，内质网（Endoplasmic Reticulum, ER）作为蛋白质合成、折叠和修饰的重要场所，对细胞内外环境变化极为敏感。营养剥夺等应激条件会导致未折叠蛋白在内质网中积累，引发内质网应激（ER Stress），并激活未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response, UPR）。分子伴侣GRP78（葡萄糖调节蛋白78）是内质网应激的核心调控因子，在正常情况下与PERK等应激传感器结合保持非活性状态。当细胞受到应激时，GRP78与这些传感器解离，启动下游信号通路。值得注意的是，GRP78的翻译后修饰状态可能影响其功能，但GRP78是否发生岩藻糖基化修饰，以及这种修饰是否影响其在肿瘤葡萄糖代谢胁迫中的功能，此前尚未有研究报道。

发表在《npj Precision Oncology》上的这项研究，正是针对这些科学问题展开的系统性探索。研究人员通过整合转录组学分析、分子生物学实验和临床样本验证，揭示了FUT3介导的GRP78岩藻糖基化在结直肠癌适应葡萄糖限制微环境中的关键作用，并阐明了其通过PERK/ATF4/STC2信号轴调控肿瘤细胞生存的具体机制。

为开展本研究，研究人员运用了多种关键技术方法：收集了38例结直肠癌患者的手术样本进行临床分析；利用GEO数据库（GSE159351）和TCGA数据进行生物信息学挖掘；通过细胞培养（SW480、HCT116、LOVO细胞系）并在不同葡萄糖浓度条件下进行表型实验；采用RNA干扰和慢病毒载体构建进行基因敲低和过表达；通过质谱分析、免疫共沉淀（Co-IP）和GST-pull down验证蛋白质相互作用；使用凝集素印迹（Lectin Blotting）和免疫荧光检测岩藻糖基化水平；通过染色质免疫沉淀（ChIP）和双荧光素酶报告基因实验分析转录调控机制；并建立裸鼠异种移植模型进行体内功能验证。

葡萄糖限制诱导FUT3表达上调

研究人员首先通过RNA-seq分析葡萄糖限制下的SW480细胞，并与GSE159351数据集（HCT116细胞葡萄糖剥夺后的表达变化）进行交叉分析，发现FUT3是响应葡萄糖限制的上调基因之一。在参与岩藻糖基化的整个FUT家族中，只有FUT3在葡萄糖限制条件下显著上调。qRT-PCR和Western blot结果证实，在不同葡萄糖浓度下，CRC细胞中FUT3表达确实随葡萄糖浓度降低而上调。免疫荧光实验使用特异性结合岩藻糖的凝集素AAL（Aleuria aurantia lectin）检测发现，葡萄糖限制下CRC细胞中AAL水平增加，表明岩藻糖基化水平升高。基因集富集分析（GSEA）显示，FUT3与内质网应激相关通路，特别是未折叠蛋白反应密切相关。

过表达FUT3增强CRC细胞耐受葡萄糖限制的能力

研究人员选择了FUT3表达水平不同的CRC细胞系：HCT116（高表达）用于敲低，LOVO（低表达）用于过表达，SW480（中等表达）用于两者。Western blot验证了转染效率后，在正常葡萄糖（25 mM）和葡萄糖限制（2.5 mM）条件下观察细胞形态和数量变化。结果显示，在正常葡萄糖条件下，FUT3表达水平对CRC细胞影响较小；而在葡萄糖剥夺条件下，FUT3过表达组的CRC细胞表现出对葡萄糖限制微环境的增强耐受性，细胞数量更多，形态更正常，存活细胞数更高。流式细胞术检测细胞凋亡显示，FUT3过表达增加了CRC细胞耐受葡萄糖限制的能力，降低了凋亡水平。这些结果表明FUT3在葡萄糖限制微环境下对CRC细胞生存至关重要。

FUT3促进葡萄糖限制条件下CRC细胞的增殖

CCK-8实验和集落形成实验表明，FUT3过表达增加了葡萄糖限制条件下CRC细胞的增殖能力。多细胞球体实验显示，FUT3过表达的球体在葡萄糖限制条件下体积更大、活力更强。ATP含量测定进一步表明，FUT3过表达的CRC细胞在低葡萄糖应激下表现出增强的活力。流式细胞术细胞周期分析显示，FUT3过表达显著增加了G2/M期和S期细胞比例，降低了G0/G1期细胞比例。裸鼠异种移植模型体内实验证实，过表达FUT3的肿瘤表现出更高的Ki67染色表达，表明FUT3在体内也能促进CRC细胞增殖。

FUT3与GRP78结合并在葡萄糖限制下诱导其岩藻糖基化

为探索FUT3在葡萄糖限制微环境下可能相互作用的蛋白质，研究人员对葡萄糖限制下的SW480/FUT3过表达组进行了质谱分析，结果显示GRP78可能与FUT3相互作用。分子对接分析发现，FUT3可通过THR88、TYR305、LYS343等氨基酸残基与GRP78的GLU551、GLU310、GLY135形成氢键相互作用而稳定结合。免疫共沉淀（Co-IP）实验验证了FUT3与GRP78之间的结合。凝集素印迹检测SW480/Vector和SW480/FUT3过表达组中总GRP78和岩藻糖基化GRP78的表达，表明FUT3可能通过结合GRP78提高其岩藻糖基化水平。GST-pull down实验进一步验证了FUT3与GRP78之间的直接相互作用。

为确定FUT3与GRP78相互作用的具体位点，研究人员使用内质网蛋白提取试剂盒从SW480细胞中提取内质网蛋白，发现这些蛋白的结合也能在内质网中检测到，且增强了GRP78的岩藻糖基化水平。免疫荧光和凝集素印迹实验显示，与正常葡萄糖条件相比，葡萄糖限制环境下FUT3和GRP78的表达均增加，且它们的共定位也增加。此外，纯化的GRP78分子的AAL信号在低葡萄糖微环境中显著增强，表明低糖微环境可促进FUT3与GRP78的结合及GRP78的岩藻糖基化修饰。

通过构建针对GRP78不同外显子的一系列截短突变体，研究人员发现GRP8分子中外显子8截短的突变体（MUT-4）无法与FUT3共沉淀，表明FUT3与GRP78的结合可能发生在外显子8区域。

内质网应激相关基因预后模型开发及与STC2表达的相关性分析

研究人员基于内质网应激相关基因建立了CRC预后标志物。通过LASSO回归选择了最佳参数（lambda），获得了CRC中这些基因的LASSO系数谱。比较了低风险和高风险组中9个核心基因的表达，建立了内质网应激相关风险预后模型。多变量Cox回归森林图分析了年龄、性别、AJCC分期、TNM分期和风险评分对生存率的影响。Kaplan-Meier曲线分析低和高风险评分组的生存率，AUC曲线（AUC=0.7）评估了内质网应激相关基因的预后标志物。所有这些结果表明，基于内质网应激相关基因的预后标志物能有效预测CRC患者的生存。

此外，分析了STC2在CRC不同阶段的表达，生存分析显示STC2水平升高与预后不良相关。通过qPCR和免疫组化染色研究了FUT3、ATF4和STC2在结直肠癌样本（n=38）中的mRNA和蛋白表达相关性，数据显示FUT3与STC2表达在CRC组织中呈正相关。这些结果暗示内质网应激相关基因，特别是STC2，可能显著参与CRC进展。

FUT3通过GRP78的岩藻糖基化上调ATF4/STC2表达

研究人员探索了FUT3在葡萄糖限制条件下促进CRC细胞生存的分子机制。通过GEPIA数据库分析了ATF4与STC2的相关性，发现STC2与ATF4表达呈正相关。由于ATF4是内质网应激通路中PERK的下游基因，而PERK是GRP78介导的关键下游内质网应激通路之一，研究人员假设GRP78的岩藻糖基化可能通过促进PERK与GRP78解离而激活PERK/ATF4通路。

免疫共沉淀检测SW480/Vector和SW480/FUT3过表达组中GRP78和PERK的结合，发现FUT3过表达促进GRP78和PERK的解离。在高（25 mM）或限制（2.5 mM）葡萄糖条件下，从SW480/Vector、SW480/FUT3过表达、HCT116/NC和HCT116/siFUT3组获取ATF4和STC2的Western blot和qRT-PCR结果，发现在葡萄糖限制微环境中，FUT3可促进PERK/ATF4相关通路的激活，最终导致靶基因STC2表达增加。

为确定PERK的磷酸化和激活是否直接依赖于FUT3介导的GRP78岩藻糖基化，研究人员使用岩藻糖基转移酶抑制剂SGN-2FF特异性抑制GRP78岩藻糖基化，并研究其对PERK与GRP78解离及后续PERK激活的影响。免疫共沉淀和AAL实验证实，GRP78岩藻糖基化减少其与PERK的结合，促进PERK解离。下游信号分子的Western blot分析显示，抑制GRP78岩藻糖基化导致PERK及下游ATF4/STC2通路的激活减弱。

表型拯救实验通过特异性抑制岩藻糖基化（SGN-2FF）评估其对增殖和凋亡的影响。细胞周期实验、平板克隆实验、CCK8实验和凋亡实验研究了FUT抑制剂（SNG-2FF）对葡萄糖剥夺条件下过表达FUT3的结肠癌细胞增殖和凋亡的影响。结果表明，抑制岩藻糖基化显著减弱了FUT3介导的CRC在低葡萄糖条件下的增殖和抗凋亡能力。

FUT3/ATF4/STC2轴增强CRC的增殖

最后，研究人员通过拯救实验研究了FUT3是否通过促进PERK/ATF4/STC2轴的激活来增强CRC的增殖和抗凋亡。首先，证明FUT3促进ATF4的核转位并启动STC2的转录激活。核质分离实验和免疫荧光实验检测2.5 mM葡萄糖条件下ATF4的表达和核输入，结果表明FUT3可激活PERK/ATF4通路并增加转录因子ATF4的核转位。

使用JASPAR鉴定了STC2上的ATF4结合 motif。通过ChIP-qPCR和DNA琼脂糖凝胶电泳使用抗ATF4、对照IgG抗体和组蛋白H3抗体证实了ATF4与STC2预测位点的结合。荧光素酶报告实验确定ATF4结合位点（+35bp）在调节STC2转录活性中起关键作用。这些结果共同表明FUT3促进ATF4的核转位并启动STC2的转录激活。

选择PERK和STC2两个关键节点，分别使用PERK抑制剂和STC2特异性siRNA进行拯救实验。qPCR和Western blot证实PERK抑制剂有效抑制了下游ATF4/STC2通路的激活。集落形成、3D球体和CCK-8实验表明，在低葡萄糖条件下，PERK抑制不仅自身减少CRC增殖，而且拯救了FUT3过表达诱导的增强增殖能力。相应地，流式细胞术凋亡分析显示，PERK抑制促进低葡萄糖应激下CRC的凋亡，并逆转了FUT3过表达赋予的抗凋亡效应。

关于STC2敲低的拯救，通过qPCR和Western blot验证了siSTC2的效率。集落形成、3D球体和CCK-8实验表明，STC2敲低显著减弱了FUT3过表达驱动的低葡萄糖条件下CRC增殖增加。一致地，流式细胞术凋亡染色表明STC2敲低促进FUT3过表达细胞的凋亡。

这些结果支持结论：FUT3通过激活PERK/ATF4/STC2轴，在低葡萄糖条件下促进CRC增殖并抑制凋亡。

研究结论与意义

本研究系统阐明了结直肠癌在葡萄糖限制微环境中通过上调FUT3表达，介导GRP78岩藻糖基化修饰，进而激活PERK/ATF4/STC2信号轴，最终增强肿瘤细胞适应能力和生存优势的分子机制。这一发现不仅揭示了糖代谢与蛋白质翻译后修饰在肿瘤应激适应中的交叉对话，也为理解肿瘤微环境调控提供了新视角。

研究的创新性在于首次报道了GRP78的岩藻糖基化修饰及其在肿瘤葡萄糖代谢胁迫中的功能作用，明确了FUT3与GRP8的直接相互作用位点，并完整解析了从岩藻糖基化修饰到转录调控的全程信号通路。特别是发现低葡萄糖微环境特异性激活FUT3-GRP78轴的现象，解释了肿瘤细胞在营养匮乏区域维持生存的适应性策略。

在转化医学方面，该研究为结直肠癌治疗提供了潜在的新靶点。STC2作为下游效应分子，可望成为预后生物标志物和治疗靶标。岩藻糖基化抑制剂SGN-2FF在实验中显示出逆转FUT3介导的肿瘤适应能力的潜力，为开发靶向肿瘤代谢微环境的治疗策略提供了实验依据。同时，基于内质网应激相关基因建立的预后模型对临床预后评估具有参考价值。

研究的局限性在于仅在有限的人类结直肠癌细胞系中验证了发现，需要在更广泛的临床样本中进一步证实结论的普适性。未来结合单细胞测序和空间转录组学技术，探索FUT3在肿瘤组织中的空间表达分布及其与肿瘤血管和营养代谢的关系，将是重要的研究方向。

总之，这项研究深入揭示了结直肠癌在代谢压力下的适应机制，为理解肿瘤生物学提供了新见解，并为开发靶向肿瘤微环境的精准治疗策略奠定了理论基础。相关发现发表在《npj Precision Oncology》期刊，对肿瘤代谢研究和临床实践均有重要意义。